【摘要】：研究背景：結(jié)核病是一個(gè)全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題,我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)及廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)流行嚴(yán)重的國(guó)家之一。因此，結(jié)核病的防治形勢(shì)依然相當(dāng)嚴(yán)峻。已有研究證實(shí)γδ T細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌抗原的刺激有較強(qiáng)的應(yīng)答活性，提示γδ T細(xì)胞可能與宿主抗結(jié)核感染的保護(hù)性免疫作用相關(guān)。但γδ T細(xì)胞參與非特異性或/和特異性抗結(jié)核免疫反應(yīng)的機(jī)制并沒(méi)有完全清楚。產(chǎn)生IL-17的γδ T細(xì)胞也可能涉及TB的發(fā)病過(guò)程。γδ T細(xì)胞是受到何種條件和調(diào)控機(jī)制產(chǎn)生這種炎癥性細(xì)胞因子IL-17的，這對(duì)于了解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制有一定的學(xué)術(shù)理論意義。通常測(cè)定產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞應(yīng)用的是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生，其刺激劑為非抗原特異性的PMA+Ionomycin，而具有抗原特異性的Mtb-HAg刺激γδ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的測(cè)定報(bào)道很少。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（T.SPOT-TB）通過(guò)檢測(cè)IFN-γ濃度反映釋放IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)目，準(zhǔn)確判斷是否存在結(jié)核菌感染，敏感性和特異性較高，但對(duì)于檢測(cè)γδ T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的報(bào)道很少。TNF-α是參與結(jié)核病的免疫應(yīng)答及免疫發(fā)病過(guò)程的一種重要因子，目前已知的研究中關(guān)于其在結(jié)核感染狀態(tài)下外周血中的含量研究較少。 目的：檢測(cè)健康人，TB患者外周血分離成單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）后用非特異性刺激劑（PMA+Iono、PHA）和特異性刺激劑（Mtb-HAg）刺激后，用流式細(xì)胞術(shù)或ELISPOT方法檢測(cè)T細(xì)胞亞群產(chǎn)生IFN-γ和IL-17以及TNF-α的變化，以描述健康人和TB患者之間γδ T細(xì)胞天然性免疫和特異性免疫的差異，為T(mén)B患者不同病程階段免疫功能狀態(tài)的判定提供新的指標(biāo)。 方法：1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同刺激劑刺激γδ T細(xì)胞后產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的細(xì)胞 采集健康人外周血，分別用PMA+Iono、Mtb-HAg、Mtb-HAg+IL-23、PHA、PHA+IL-23刺激培養(yǎng)，PMA+Iono刺激培養(yǎng)6小時(shí)，其余組刺激培養(yǎng)16小時(shí)，每組均加入莫能霉素（Monensin）阻斷4小時(shí)，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記單抗進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的γδ T細(xì)胞比例，同時(shí)檢測(cè)αβ T細(xì)胞比例作為對(duì)照。 2. ELISOPT檢測(cè)γδ T細(xì)胞不同刺激劑刺激后產(chǎn)生IFN-γ細(xì)胞 2.1健康人的外周血分離PBMC后，按10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/孔種入已包被IFN-γ抗體的孔中，對(duì)照組加入PHA、結(jié)核桿菌抗原A+結(jié)核桿菌抗原B，剩余細(xì)胞用免疫磁珠分選出γδ+T后，，通過(guò)熒光染色確定細(xì)胞數(shù)后，按1.5萬(wàn)/孔，3萬(wàn)/孔，6萬(wàn)/孔種入板中，37℃培養(yǎng)20h后洗滌孵育顯色，最后檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)計(jì)算產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)。 2.2健康人的外周血分離PBMC后，按10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/孔種入已包被IFN-γ的孔中，對(duì)照組加入PHA、結(jié)核桿菌抗原A+結(jié)核桿菌抗原B，剩余細(xì)胞用免疫磁珠分選出γδ+T后，通過(guò)熒光染色確定細(xì)胞數(shù)后，按3萬(wàn)-5萬(wàn)細(xì)胞/孔種入板中，37℃培養(yǎng)20h后洗滌孵育顯色，最后檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)計(jì)算產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同刺激劑刺激γδ T細(xì)胞后產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的細(xì)胞 采集健康人和TB患者外周血（或凍存的PBMC），分別用PMA+Iono、Mtb-HAg、PHA刺激培養(yǎng)，PMA+Iono刺激培養(yǎng)6小時(shí)，其余組刺激培養(yǎng)16小時(shí)，每組均加入莫能霉素（Monensin）阻斷4小時(shí)，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記單抗進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的γδ T細(xì)胞比例，同時(shí)檢測(cè)αβ T細(xì)胞比例作為對(duì)照。 結(jié)果：1.1健康人外周血T細(xì)胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個(gè)亞群均能產(chǎn)生IFN-γ，產(chǎn)生IFN-γ的γδ T細(xì)胞比例比產(chǎn)生IFN-γ的αβ T細(xì)胞比例要高。其中Mtb-HAg組健康人外周γδ T產(chǎn)生的IFN-γ比例明顯高于αβ T細(xì)胞，差異有顯著性（p0.01）。 1.2健康人外周血T細(xì)胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個(gè)亞群均能產(chǎn)生IL-17。 PMA組、Mtb-HAg組、Mtb-HAg+IL-23組及PHA組，健康人外周γδ T產(chǎn)生的IL-17比例明顯高于αβ T細(xì)胞，差異均有顯著性(p＜0.05）。 2.用ELISPOT方法檢測(cè)Mtb-HAg刺激外周血γδ T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ斑點(diǎn)的每孔最適細(xì)胞數(shù)約為30000—50000個(gè)γδ+T細(xì)胞。 3.1健康人及結(jié)核病人外周血T細(xì)胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個(gè)亞群均能產(chǎn)生IFN-γ，產(chǎn)生IFN-γ的γδ T細(xì)胞比例比產(chǎn)生IFN-γ的αβ T細(xì)胞比例要高。PMA組健康人外周αβ T產(chǎn)生的IFN-γ比例明顯高于結(jié)核病人組，差異有顯著性（p0.05）；PMA組、Mtb組和PHA組健康人外周γδ T產(chǎn)生的IFN-γ比例高于結(jié)核病人組，差異有顯著性，分別為p0.05，p0.01和p0.05 3.2健康人及結(jié)核病人外周血T細(xì)胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個(gè)亞群均能產(chǎn)生TNF-α。 PMA組和PHA組健康人外周αβ T產(chǎn)生的TNF-α比例高于結(jié)核病人組，差異有顯著性（p0.05）；PMA組和PHA組健康人外周γδ T產(chǎn)生的TNF-α比例高于結(jié)核病人組，差異有顯著性，分別為p0.05和p0.05。 結(jié)論：1. Mtb-HAg刺激健康人外周γδT細(xì)胞后產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞顯著高于αβ T細(xì)胞。 2.健康人γδ T細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)均比TB患者的高。 3.健康人γδ T細(xì)胞中產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞數(shù)比αβ T細(xì)胞中的高。 4.不管是健康人還是結(jié)核病人，產(chǎn)生TNF-α的γδ T細(xì)胞的比例均高于產(chǎn)生TNF-α的αβ T細(xì)胞的比例。 5.通過(guò)非特異性刺激劑刺激健康人γδ T細(xì)胞中分泌TNF-α細(xì)胞的比例高于結(jié)核病人γδ T細(xì)胞中的比例。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Interleukin 17-Producing γδ T Cells Increased in Patients with Active Pulmonary Tuberculosis[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年03期

2 林小田;謝媛琪;王昱;喻云梅;蔡立莉;姜泓;;肺結(jié)核病患者外周血前炎性因子及細(xì)胞亞群凋亡的研究[J];華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志;2009年05期

3 王心靜;曹志紅;劉宇;楊秉芬;程小星;;ESAT-6,CFP-10誘導(dǎo)的活動(dòng)期肺結(jié)核患者PBMCs細(xì)胞因子的特點(diǎn)[J];免疫學(xué)雜志;2012年08期

4 于亮,王梅,馬雪銀;老年肺結(jié)核支氣管肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子(TNF-α)及白介素-1β的檢測(cè)及臨床意義[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年01期

5 傅瑞全,韋振空;42例結(jié)核病患者免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析[J];醫(yī)學(xué)文選;2005年05期

6 陳蘭舉;張慧潔;陳名武;丁周志;潘家華;李柏青;;外周血T細(xì)胞亞群在小鼠結(jié)核感染中的意義[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2007年03期

7 全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組;第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2002年01期

8 唐神結(jié),肖和平,范以虎,吳福蓉,張忠順,李紅,楊妍;肺結(jié)核患者血清前炎細(xì)胞因子及其受體的變化[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2002年06期

9 張瑛;孫亞蒙;徐欣暉;呂利雄;;結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核性疾病中的診斷價(jià)值[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年12期

10 王爽;楊恩卓;王洪海;沈洪波;;新型抗結(jié)核蛋白亞單位疫苗Ag85A-γ干擾素的免疫效果評(píng)價(jià)[J];微生物與感染;2012年03期

本文編號(hào)：2527478