【摘要】： 目的 本實驗探討了神經(jīng)生長因子(NGF)對體外培養(yǎng)的新生鼠神經(jīng)干細胞生長和分化的影響,以及神經(jīng)生長因子對神經(jīng)軸突形成和生長的作用。 方法 1、材料:2-3天的新生SD大鼠,均由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。 2、主要試劑:DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、B27因子、EGF因子、bFGF因子、NGF因子和Nestin、NSE、GFAP免疫化學試劑盒。 3、實驗方法和結果判定:體外分離培養(yǎng)新生SD大鼠神經(jīng)干細胞。培養(yǎng)過程中通過光學顯微鏡觀察干細胞的生長情況。再通過Nestin、NSE和GFAP免疫組化染色對培養(yǎng)細胞進行鑒定。繼續(xù)進行分組分化培養(yǎng)(10%FBS組作為對照組,NGF+10%FBS組作為實驗組;),分化培養(yǎng)6天后對培養(yǎng)細胞進行NSE免疫組化染色,并對實驗組和對照組的NSE陽性細胞數(shù)進行計數(shù),求得NSE陽性細胞數(shù)。通過對神經(jīng)元附加同心圓對細胞軸突的數(shù)量進行計數(shù)。 4、統(tǒng)計學處理:統(tǒng)計學處理采用SPSS統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)+標準差表示,P＜0.01有統(tǒng)計學意義。 結果 本實驗結果顯示:所培養(yǎng)出的細胞團均為Nestin陽性,誘導分化后均可產生NSE和GFAP陽性細胞。分組分化培養(yǎng)后NGF組中神經(jīng)元所占比例為12.93±2.4,對照組神經(jīng)元所占的比例約為5.83±1.7,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。對兩組神經(jīng)軸突的數(shù)量進行分析后,NGF組中單個神經(jīng)元的軸突數(shù)量平均為8.9±0.9,對照組中單個神經(jīng)元軸突數(shù)量平均為3.9±0.2,對兩組結果進行統(tǒng)計學分析后,結果具有差異性(P＜0.01)。 討論 神經(jīng)干細胞因具有高度自我更新能力、多潛能分化、低免疫原和遷移功能等特性。本次試驗通過對不同培養(yǎng)階段的細胞進行觀察,原代培養(yǎng)第二天開始出現(xiàn)細胞克隆團,此細胞團體積不斷擴增而且數(shù)量也在不斷增多。傳至第4代時進行單克隆培養(yǎng),單克隆細胞團經(jīng)過Nestin免疫細胞化學染色顯示均成呈陽性,而且經(jīng)過分化培養(yǎng)后均能產生NSE和GFAP陽性細胞。這些都表明了所培養(yǎng)細胞是具有高度自我復制能力和分化能力的神經(jīng)干細胞。對此神經(jīng)干細胞分組分化培養(yǎng),并進行細胞計數(shù),計算NSE陽性細胞數(shù)的結果顯示實驗組NSE陽性細胞數(shù)明顯高于對照組,這一結果也證實了NGF可促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元。 本次試驗還觀察了在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化過程中NGF對軸突生長的作用,結果顯示加入NGF的實驗組中的軸突數(shù)量遠遠大于對照組。這說明NGF在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化過程中,能夠促進那些未長出軸突的神經(jīng)細胞向極化狀態(tài)轉變并增加生長錐的生成,最終增加分化后神經(jīng)元軸突數(shù)量。 通過將本次試驗與其它關于NGF促進軸突生長和再生的實驗相聯(lián)系,不難推測:神經(jīng)元在初期生長出生長錐和軸突的機制與后期軸突出芽、分枝和再生的機制可能基本相同,即使這兩個機制不相同,也有一點不可否認,就是這兩種機制均能能夠被NGF所啟動。下一步實驗應該進一步研究NGF在此過程中所采用的是什么樣的信號傳到途徑,究竟引發(fā)了什么樣的具體機制來促進神經(jīng)元初期軸突的形成和生長,這將對神經(jīng)干細胞應用于臨床有重大意義。 結論 NGF可促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元,還可以促進神經(jīng)干細胞分化的神經(jīng)元軸突數(shù)量的增加。
【圖文】：

孔中連續(xù)觀察5個NSE染色陽性的未與其它神經(jīng)元助于如圖所示的以神經(jīng)元為圓心的同心圓，分別計數(shù)米圓環(huán)內的突出數(shù)量[7]。將兩者均值視為神經(jīng)元突觸驗(P<0.05)，比較組間軸突數(shù)量有無顯著差異。

將單克隆神經(jīng)干細胞團進行Nestin免疫細胞化學染色，絕大多數(shù)細胞均呈陽性反映。細胞團由成百上千個Nestin陽性細胞構成，細胞團周圍可見少量的散在的Nestin陽性細胞，，形狀多成三角形。(如圖3A)。對誘導分化后的細胞分別進行GFAP(如圖3B)和NSE染色(如圖3C)，均有染色陽性細胞存在。圖3，免疫細胞化學染色(X加0)。圖3A:神經(jīng)干細胞團的Nestin染色;圖3B:神經(jīng)干細胞分化后G凡J染色;圖3C:神經(jīng)干細胞分化后NSE染色;三、神經(jīng)元數(shù)量及軸突長度和數(shù)量的比較結果誘導分化后第一天可見一定數(shù)量的細胞貼壁生長，并可見少量的放射狀軸突，繼續(xù)觀察，貼壁生長的細胞不斷增多，軸突數(shù)量及長度也在不斷增長。誘導
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2527577