【摘要】： 鐵是人體必需微量元素中含量最多的一種,參與機(jī)體許多重要的生理功能,鐵過多或過少對機(jī)體都會造成損害。鐵缺乏對人體影響被了解的同時,鐵過負(fù)荷對人體的危害也越來越受到重視。有資料顯示,肝鐵過負(fù)荷可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化；遲發(fā)性皮膚卟啉癥和肝細(xì)胞癌等疾病。 肝臟是機(jī)體鐵貯存的主要部位,在鐵代謝中發(fā)揮著中心和樞紐的作用。為了維持鐵平衡,肝細(xì)胞存在精細(xì)的鐵調(diào)控機(jī)制,可以維持正常生命活動所需的鐵量,同時又會避免鐵過多蓄積而產(chǎn)生的毒性作用。然而課題組研究發(fā)現(xiàn)心理應(yīng)激可以引起肝鐵蓄積,肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,但機(jī)制尚不明確。 眾所周知,應(yīng)激情況下糖皮質(zhì)激素大量分泌,文獻(xiàn)報道,糖皮質(zhì)激素能夠調(diào)控大鼠腸道內(nèi)鐵蛋白輕鏈重鏈的表達(dá),增加垂體切除鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的含量,有意義的是,課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激情況下,糖皮質(zhì)激素受體和STAT5與鐵調(diào)節(jié)蛋白1基因啟動子位點(diǎn)上的相應(yīng)DNA序列結(jié)合活性增強(qiáng),綜合國內(nèi)外相關(guān)研究,提示心理應(yīng)激情況下的肝鐵蓄積可能與糖皮質(zhì)激素的大量分泌導(dǎo)致鐵調(diào)控蛋白的表達(dá)改變有關(guān)。應(yīng)激在現(xiàn)代社會無處不在,闡明應(yīng)激肝鐵紊亂的機(jī)制對防治應(yīng)激損傷具有積極的意義。 研究目的 了解心理應(yīng)激糖皮質(zhì)激素大量分泌與肝鐵蓄積的關(guān)系,及心理應(yīng)激導(dǎo)致肝鐵蓄積的機(jī)制,為闡明心理應(yīng)激情況下肝鐵代謝紊亂、肝鐵蓄積的機(jī)制提供實驗基礎(chǔ),并為防治與肝鐵蓄積相關(guān)的疾病提供線索。 研究方法 1.心理應(yīng)激對大鼠肝鐵濃度及鐵調(diào)控蛋白的影響 1.1實驗動物分組 雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司),體重(120±10)g。按體重隨機(jī)分為空白對照組、心理應(yīng)激組和足底電擊組,每組10只。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50%～60%；使用不銹鋼籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食,自然晝夜節(jié)律變化光照。 1.2大鼠心理應(yīng)激模型的制作 采用Communication Box System制作大鼠心理應(yīng)激模型。Communication Box System由透明丙烯酸板組成,一半小室(A室)底部鋪板絕緣,另一半小室(B室)通電。在B室的實驗大鼠接受30min/d,足底電擊(電壓90V,電流0.80mA)；電擊組大鼠跳躍,尖叫,在A室的實驗大鼠通過視覺聽覺產(chǎn)生恐懼的心理反應(yīng),即為心理應(yīng)激大鼠模型。 1.3大鼠肝組織鐵含量的測定 采用原子吸收分光光度計(日本日立公司Z-2000型)火焰法測定。100μ/ml鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液(GBW08616)由國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。 1.4大鼠肝臟Fn, TfR1, IRP1, IRP2 mRNA表達(dá)量的測定 采用實時定量熒光PCR法測定心理應(yīng)激組和對照組大鼠肝臟內(nèi)鐵蛋白,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1,鐵調(diào)節(jié)蛋白1及鐵調(diào)節(jié)蛋白2 mRNA的表達(dá)水平。 1.5大鼠肝臟Fn,TfR1,IRP1蛋白含量的測定 Western blot測定實驗組和對照組大鼠肝臟內(nèi)鐵蛋白,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1以及鐵調(diào)節(jié)蛋白1的蛋白含量。 2.注射糖皮質(zhì)激素對肝鐵濃度及鐵調(diào)控蛋白的影響 2.1實驗動物分組 雄性SD大鼠(購白上海西普爾-必凱公司),體重(200±10)g。按體重隨機(jī)分為0.9%生理鹽水組,10-9 mol/L皮質(zhì)酮組,10-6mol/L皮質(zhì)酮組和RU486組,每組10只。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50%～60%；使用不銹鋼籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食,自然晝夜節(jié)律變化光照。 2.2實驗動物模型制作 大鼠尾靜脈注射0.9%生理鹽水,10-7mol/L皮質(zhì)酮,10-4 mol/L皮質(zhì)酮或10-2mol/L RU486(1h后再注射104 mol/L皮質(zhì)酮),按照0.1ml/100g bw注射試劑,連續(xù)7天注射后腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,暴露胸腔,剪開右心耳,然后迅速經(jīng)心臟冷PBS沖洗,取出大鼠肝臟存-80℃冰箱備用。 2.3大鼠肝組織鐵含量的測定：同前。 2.4大鼠肝臟Fn,TfR1,IRP1mRNA和蛋白含量的測定：同前。 3.糖皮質(zhì)激素調(diào)控肝細(xì)胞鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)的分子機(jī)制研究 3.1細(xì)胞培養(yǎng) 選用人正常肝細(xì)胞HL7702, RPMI1640培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、雙抗,培養(yǎng)箱中生長。 3.2氫化可的松干預(yù)細(xì)胞 用精密電子天平稱取3.6247mg的氫化可的松,用無水乙醇稀釋溶解至1ml,配成10-2mol/L,用1640培養(yǎng)液稀釋成10-5,10-6,10-7,10-8,10-9mol/L后加入HL7702細(xì)胞。 3.3 CCK-8法測定肝細(xì)胞活性 棄去培養(yǎng)HL7702細(xì)胞96孔板中的上清,PBS漂洗3次加入CCK-8反應(yīng)液,于37℃孵育2h,使用酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。以實驗組吸光度值與對照組的吸光度值之百分比作為細(xì)胞相對活性。 3.4阻斷HL7702細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體或STAT5 用精密電子天平稱取4.2959mg的RU486,用無水乙醇稀釋溶解至1ml,配成10-2mol/L的RU486,用1640培養(yǎng)液稀釋為10-5mol/L后加入HL7702細(xì)胞,半小時后再加入10-6mol/L氫化可的松。 用精密電子天平稱取適量STAT5抑制劑溶于DMSO,使終濃度達(dá)到10mg/ml。 3.5肝細(xì)胞IRP1和STAT5 mRNA及蛋白含量的測定 實時定量熒光PCR法測定mRNA的表達(dá)水平,Western blot測定蛋白含量的變化。 4.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理 采用quantity one圖像分析系統(tǒng)對Western條帶進(jìn)行灰度分析,實驗數(shù)據(jù)用(X±S)表示。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析,兩組間差異采用成組設(shè)計資料的t檢驗,多組間差異采用單因素方差分析。各組方差齊時,對照組與各實驗組間比較采用Dunnett法,各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗和SNK-q檢驗；方差不齊時采用Dunnett's C檢驗,P0.05為顯著性水平,P0.01為非常顯著性水平。 結(jié)果 1.心理應(yīng)激對大鼠肝鐵濃度及鐵調(diào)控蛋白的影響 1.1心理應(yīng)激對大鼠肝鐵含量的影響 7天心理應(yīng)激組大鼠肝鐵含量與對照組比較升高幅度達(dá)到52.7%(P0.01)；與1天和3天心理應(yīng)激組比較分別升高了40.8%(P0.01)和31.8%(P0.05)而1天和3天心理應(yīng)激組大鼠肝鐵含量較對照組有升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 1.2心理應(yīng)激對大鼠肝臟Fn, TfR1, IRP1, IRP2 mRNA表達(dá)的影響 大鼠肝臟Fn mRNA表達(dá)在1天和3天心理應(yīng)激后與對照組比較有降低趨勢,在7天心理應(yīng)激后較對照組明顯降低(P0.05)；大鼠肝臟TfR1 mRNA表達(dá)在1天和3天心理應(yīng)激后與對照組比較有升高趨勢,7天心理應(yīng)激后較對照組明顯升高(P0.05)；而大鼠肝臟IRP1 mRNA表達(dá)在1,3,7天心理應(yīng)激后較對照組均有顯著升高,其中7天心理應(yīng)激組升高幅度最大,達(dá)到36%(P0.05)；大鼠肝臟IRP2mRNA表達(dá)各組間均無明顯變化(P0.05)。 1.3心理應(yīng)激對大鼠肝臟Fn, TfR1, IRP1蛋白含量的影響 心理應(yīng)激1天和3天時,大鼠肝臟Fn, TfR1蛋白表達(dá)與對照組相比無顯著性差異,7天心理應(yīng)激時與對照組相比,大鼠肝臟Fn蛋白表達(dá)降低,而TfRl蛋白表達(dá)升高(P0.05)；1,3,7天心理應(yīng)激組大鼠肝臟IRP1蛋白表達(dá)較對照組均有增加,分別增加1.5倍(P0.05),1.8倍(P0.05)和2.6倍(P0.01) 2.注射糖皮質(zhì)激素對大鼠肝鐵濃度及鐵調(diào)控蛋白的影響 2.1注射皮質(zhì)酮對大鼠肝鐵含量的影響 10-9mol/L皮質(zhì)酮組大鼠肝鐵含量與0.9%生理鹽水組相比無顯著差異,但連續(xù)7天每天注射10-6mol/L皮質(zhì)酮后,大鼠肝鐵含量與0.9%生理鹽水組比較有顯著上升,升高39.5%(P0.05),與連續(xù)7天注射10-9mol/L皮質(zhì)酮組比較也升高了39.1%(P0.05)2.2注射皮質(zhì)酮對大鼠肝臟Fn, TfR1, IRP1 mRNA表達(dá)的影響 10-9mol/L皮質(zhì)酮組Fn, TfR1 mRNA的表達(dá)與0.9%生理鹽水組相比無顯著性差異,而10-6 mol/L皮質(zhì)酮連續(xù)注射7天后Fn mRNA表達(dá)較0.9%生理鹽水組降低,TfR1 mRNA表達(dá)較生理鹽水組升高,大鼠肝臟IRP1 mRNA表達(dá)在注射10-9和10-6。mol/L皮質(zhì)酮后較0.9%生理鹽水組均有升高,分別較對照組增高1.2倍和1.5倍(P0.05)。 2.3注射皮質(zhì)酮對大鼠肝臟Fn,TfR1,IRP1蛋白含量的影響 Western blot顯示大鼠肝臟Fn,TfR1蛋白表達(dá)在連續(xù)7天給予10-9mol/L皮質(zhì)酮后與0.9%生理鹽水組相比無顯著性差異,而連續(xù)注射10-6mol/L皮質(zhì)酮7天后,與0.9%生理鹽水組比較,Fn蛋白表達(dá)降低,TfR1蛋白表達(dá)升高(P0.05),10-9mol/L和10-6mol/L皮質(zhì)酮組的IRP1蛋白表達(dá)較0.9%生理鹽水組均升高(P0.05) 3.糖皮質(zhì)激素調(diào)控肝細(xì)胞鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)的分子機(jī)制研究 3.1氫化可的松對HL7702細(xì)胞IRP1mRNA表達(dá)的影響 細(xì)胞內(nèi)加入10-6,10-7,10-8,10-9。mol/L氫化可的松24h后HL7702細(xì)胞IRP1mRNA表達(dá)較對照組均增高,分別增高1.65倍,1.38倍,1.37倍和1.38倍(P0.05),10-6mol/L氫化可的松組的IRP1 mRNA表達(dá)較其他劑量氫化可的松組均增高(P0.05),而10-5mol/L糖皮質(zhì)激素組IRP1mRNA表達(dá)與對照組無顯著差異。 3.2氫化可的松對HL7702細(xì)胞IRP1蛋白含量的影響 Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)加入10-6,10-7,10-8,10-9mol/L氫化可的松24h后HL7702細(xì)胞IRP1蛋白含量較對照組均增高(P0.05),其中10-6mol/L氫化可的松組IRP1蛋白含量與10-7mol/L組比差異不顯著(P0.05),與10-8,10-9mol/L組比較IRP1蛋白含量均增高(P0.05),而10-Smol/L組IRP1含量與對照組無顯著差異,CCK-8檢測顯示,10-5mol/L組的肝細(xì)胞活性與對照組相比顯著降低(P0.01)。 3.3阻斷糖皮質(zhì)激素受體對大鼠肝臟IRP1含量的影響 大鼠尾靜脈注射10-4mol/L糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU486 1小時后注射10-6mol/L皮質(zhì)酮,發(fā)現(xiàn)IRP1 mRNA表達(dá)較10-6mol/L皮質(zhì)酮組明顯降低(P0.05)。IRP1蛋白含量變化與mRNA一致,RU48+皮質(zhì)酮組大鼠肝臟IRP1蛋白含量較單純加皮質(zhì)酮組明顯降低(P0.05)。 3.4阻斷糖皮質(zhì)激素受體對HL7702細(xì)胞IRP1含量的影響 RT-PCR結(jié)果顯示HL7702細(xì)胞內(nèi)加入10-5 mol/L RU486后可以降低氫化可的松誘導(dǎo)的IRP1的生成,與10-6mol/L氫化可的松組對比降低達(dá)3倍(P0.05)。Western blot結(jié)果同樣顯示RU486可以降低氫化可的松誘導(dǎo)的IRP1蛋白生成。 3.5氫化可的松對STAT5表達(dá)的影響 HL7702細(xì)胞內(nèi)加入10-6mol/L氫化可的松后,STAT5的mRNA及蛋白表達(dá)較對照組均無顯著差異(P0.05),Western blot結(jié)果顯示,在給予10-6mol/L氫化可的松后,HL7702細(xì)胞內(nèi)P-STAT5蛋白含量較對照組明顯升高(P0.05)。 3.6抑制STAT5對HL7702細(xì)胞IRP1生成的影響 抑制STAT5后,HL7702細(xì)胞IRP1蛋白表達(dá)較10-6mol/L氫化可的松組明顯降低(P0.05)。 3.7同時阻斷糖皮質(zhì)激素受體和STAT5對HL7702細(xì)胞IRP1生成的影響 當(dāng)同時阻斷糖皮質(zhì)激素受體和STAT5后再給予氫化可的松,HL7702細(xì)胞中IRP1蛋白幾乎不表達(dá),與10-6mol/L糖皮質(zhì)激素組比較差異非常顯著(P0.01)。 結(jié)論 1.連續(xù)7天心理應(yīng)激可以引起大鼠肝臟鐵蛋白表達(dá)減少,而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達(dá)增加,肝細(xì)胞攝入鐵增加引起肝鐵蓄積；肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1含量隨著應(yīng)激天數(shù)增加而增加,通過與IRE結(jié)合轉(zhuǎn)錄后調(diào)控鐵蛋白,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達(dá)可能是心理應(yīng)激情況下肝鐵蓄積的原因。 2.連續(xù)7天每天注射10-6mol/L的皮質(zhì)酮可以引起大鼠肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)上調(diào)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1含量增加、鐵蛋白減少、肝臟鐵含量增加,與7天心理應(yīng)激后大鼠肝臟鐵代謝變化一致,結(jié)合以往研究結(jié)果提示心理應(yīng)激時糖皮質(zhì)激素的大量分泌可能是導(dǎo)致大鼠肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)增加的重要原因。 3.通過整體動物和細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素可以上調(diào)鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)。分別采用特異性糖皮質(zhì)激素受體抑制劑RU486或STAT5抑制劑后,鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)有不同程度的降低,而在培養(yǎng)基中同時添加上述兩種抑制劑幾乎可完全抑制鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá),表明糖皮質(zhì)激素可通過增強(qiáng)GR和STAT5信號通路上調(diào)鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)。 綜上所述,心理應(yīng)激時糖皮質(zhì)激素大量釋放,通過GR和STAT5與鐵調(diào)節(jié)蛋白1基因位點(diǎn)上的相應(yīng)DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,上調(diào)鐵調(diào)節(jié)蛋白1基因的表達(dá),隨著鐵調(diào)節(jié)蛋白1含量的逐漸增加,與IRE結(jié)合,通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控引起轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達(dá)增加,鐵蛋白表達(dá)減少,肝細(xì)胞攝入鐵增加,導(dǎo)致肝鐵蓄積肝臟損傷。
【圖文】：

皮質(zhì)酮組明顯降低(P<0.05)。IRPI蛋白含量變化與mRNA一致，RU486組大鼠肝臟x即一蛋白含量較10’gmol幾和10一6molzL皮質(zhì)酮組均明顯降低(P<0.05)(圖 3.4，圖3.5)。 TranseriPtlevelsofIRPIinratliverinjeeted withRU486R110.0口s州尸的叫的。lAa 0.6 0.4沁aA工叫VN創(chuàng)曰工d國工E一 6GCRU486q‘nll0.尸目沁U叫。A叫4洲司。﨑67

7.抑制S腸燈{5對HL7702細(xì)胞IRPI生成的影響抑制sTAI，5后，HL7702細(xì)胞IRPI蛋白表達(dá)較10一“mol幾氫化可的松組明顯降低(p<0.05)(圖3.10)8.同時阻斷糖皮質(zhì)激素受體和51’AI…5后對HL7702細(xì)胞I即1生成的影響當(dāng)同時阻斷糖皮質(zhì)激素受體和ST誘JS后再給予氫化可的松，HL7702細(xì)胞中IRPI蛋白幾乎不表達(dá)，，與10一mo比糖皮質(zhì)激素組比較差異非常顯著(P<0.01)(圖 3.10)。10一 6GCinhibitorSrl’A1， 5inhibitor STATSinhibitorandRU486ACtin一的。Aa一囚O卜卜悶Hu﨏a尸。JO蓬。A一一尸門。﨑s洲aA。工霍囚O悶卜卜HUl祠心O抽E一 66CSTATSinhibitorE一 6GCSTATSinhibitor+RU486aA﨏尸司

本文編號：2527417