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E3泛素連接酶CHIP介導(dǎo)HIF-1α降解的機制探討

發(fā)布時間:2019-08-14 09:18
【摘要】: 腫瘤含氧量(tumor oxygenation)在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著巨大的作用。生理狀態(tài)下,絕大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞處于低氧狀態(tài)(hypoxia)并且發(fā)生許多功能性的改變。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)作為一種對氧氣敏感的轉(zhuǎn)錄因子超家族(transcription factor super family),主要負(fù)責(zé)眾多的低氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控。HIFs主要由三個成員組成:HIF-1、HIF-2(Endothelial PAS domain protein 1,EPAS1)和HIF-3(Inhibitory PAS protein,IPAS);罨腍IF是由HIF-αand HIF-β亞基構(gòu)成的異二聚體,前者是氧氣敏感的亞基,在常氧條件下極不穩(wěn)定;后者,也被稱作ARNT(arylhydrocarbon receptornuclear translocator)是組成性表達(dá)的。HIF-1α主要包含5個功能結(jié)構(gòu)域:bHLH(basichelix-loop-helix)、PAS(PER-ARNT-SIM)、NAD(N-terminal activation domain)、CAD(C-terminal activation domain)及ODD(oxygen-dependent degradation)結(jié)構(gòu)域。bHLH結(jié)構(gòu)域不僅對于HIF1與DNA的結(jié)合是必需的,同時還與PAS結(jié)構(gòu)域一起參與同HIF-1b亞基的結(jié)合。NAD和CAD結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,與NAD結(jié)構(gòu)域部分重疊的ODD結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)翻譯后修飾,對于HIF-1α的蛋白穩(wěn)定性具有重要的調(diào)節(jié)作用。 已知,HIF-1α蛋白ODD結(jié)構(gòu)域的兩個脯氨酸位點(Pro402和Pro564)可以被羥基化酶超家族PHDs(prolyl hydroxylase domain-containing proteins)羥基化修飾(hydroxylation)。羥基化修飾的HIF-1a蛋白易于與特異的E3泛素連接酶VHL(Von Hippel-Lindau)相結(jié)合,從而通過泛素蛋白酶體途徑降解,這也是低氧誘導(dǎo)因子HIF-1a蛋白在常氧下極不穩(wěn)定的主要因素。除了羥基化修飾,HIF-1a還可以進(jìn)行磷酸化(phosphorylation)、乙;╝cetylation)和S-nitrosylation等修飾,這些不同的修飾狀態(tài)對HIF-1a的生物活性及穩(wěn)定性具有重要的影響。就乙;,ARD1(arrest-defective-1 protein)作為一種乙;,首先被發(fā)現(xiàn)可以在小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)乙;疕IF-1a蛋白ODD結(jié)構(gòu)域的賴氨酸位點(Lys532),導(dǎo)致其蛋白水平的下降。然而,隨后的研究表明,過表達(dá)ARD1質(zhì);蛘吒蓴_內(nèi)源性ARD1的表達(dá),在人腫瘤細(xì)胞中對于HIF-1a的蛋白穩(wěn)定性卻沒有任何影響。所以,在人腫瘤細(xì)胞中,何種乙;附閷(dǎo)HIF-1a的乙;揎椖壳斑不清楚。2007年末,通過酵母雙雜交的篩選,Semenza博士的研究小組于發(fā)現(xiàn)了兩個新型的乙;窼SAT1和SSAT2(spermidine/spermine-N-acetyltransferase-1/2)參與了人腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白的降解過程。雖然該研究小組沒有得到SSAT1或者SSAT2可以直接乙;疕IF-a的證據(jù),但其研究表明,SSAT1和SSAT2的乙;富钚詫τ谄浣閷(dǎo)HIF-1a的降解是必需的。另一方面,組蛋白去乙;福╤istone deacetylases,HDACs)也被報道參與了HIF-1a蛋白可逆的乙;揎。HDAC1可以去乙;疕IF-1a,阻止其進(jìn)入MTA1(metastasis-associated protein 1)調(diào)節(jié)的降解過程。另外,干擾HDAC4的表達(dá)可以增加HIF-1a的乙;,從而導(dǎo)致其降解。 CHIP(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein),也被稱作STUB1(STIP1homology and U-box containing protein 1),是一種與分子伴侶蛋白(chaperones)功能密切相關(guān)的一類E3泛素連接酶。許多蛋白被報導(dǎo)了可以被CHIP通過泛素蛋白酶體途徑降解,例如ErbB2、p53、tau和ER等。CHIP主要包含3個功能結(jié)構(gòu)域:一個TPR(tetratricopeptide repeat)結(jié)構(gòu)域位于氨基端,其主要負(fù)責(zé)與熱休克蛋白Hsp90(heat shock protein 90)和熱休克結(jié)合蛋白Hsc70(heat shockcognate 70)結(jié)合,發(fā)揮其分子伴侶蛋白功能;一個U-box結(jié)構(gòu)域位于碳末端,其主要負(fù)責(zé)與降解底物結(jié)合,從而發(fā)揮其E3泛素連接酶功能;一個含有兩個潛在入核信號的linker位于中間,可能主要負(fù)責(zé)CHIP的細(xì)胞內(nèi)定位。作為Hsp90的底物蛋白,Hsp90對于維持HIF-1a的蛋白穩(wěn)定性具有重要的作用。在低氧條件下,當(dāng)Hsp90的功能受到抑制(如Hsp90抑制劑的應(yīng)用),HIF-1a與Hsp90分離,同時與RACK1(receptor for activated C kinase)結(jié)合,其介導(dǎo)HIF-1a通過VHL非依賴的泛素蛋白酶體通路降解。由于目前還未有報道是否RACK1具有E3泛素連接酶活性,所以何種E3泛素連接酶參與了這一過程,目前還不是很清楚。另一方面,已有的研究表明,CHIP蛋白的E3泛素連接酶功能主要與分子伴侶蛋白Hsp90和Hsc70密切相關(guān)。除此之外,CHIP的E3泛素連接酶功能還與E2泛素結(jié)合酶,UBC4/5超家族相關(guān)。由于UBC4/5超家族有著應(yīng)激激活(stress-activated)的特性,因此,在不同的應(yīng)激狀態(tài)下,CHIP有可能在分子伴侶復(fù)合物(chaperonecomplexes)到分子伴侶依賴的降解復(fù)合物的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要的作用。 在常氧的情況下,由于羥基化酶PHD和E3泛素連接酶VHL的存在,在人腫瘤細(xì)胞中,HIF-1a幾乎不表達(dá);在低氧條件下,由于氧敏感的羥基化酶PHD的失活,導(dǎo)致了HIF-1a與E3泛素連接酶VHL的分離,從而HIF-1a可以穩(wěn)定地表達(dá),發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。有趣的是,HIF-1a的表達(dá)在低氧的條件下也不是一成不變的:HIF-1a在嚴(yán)重低氧(severe hypoxia)或者延遲低氧(prolonged hypoxia)的條件下也可以發(fā)生不同程度的降解。在嚴(yán)重低氧(severe hypoxia)的情況下,p53蛋白可以通過抑制HIF-1a的轉(zhuǎn)錄活性,來降低HIF-1a的蛋白水平,而MDM2(murine double minutes 2)則以直接或者間接的方式參與p53調(diào)節(jié)的HIF-1a的降解。已有研究證明,在HepG2腫瘤細(xì)胞中,與急性低氧(acute hypoxia,5小時,1% O_2)處理相比較,延遲低氧處理(16小時,1% O_2)可以明顯地下調(diào)HIF-1a的蛋白水平;在A549腫瘤細(xì)胞中,HIF-1a同樣在急性低氧(4小時,0.5%O_2)條件下穩(wěn)定表達(dá),但在延遲低氧的條件下,表達(dá)水平卻明顯地下降(6-12小時,0.5% O_2)。蛋白合成和蛋白降解同時參與了這一生理過程。一方面,延遲低氧可以抑制細(xì)胞蛋白合成調(diào)節(jié)者mTOR(mammalian target of rapamycin)的活性,通過抑制HIF-1a的蛋白合成來降低它的表達(dá)水平;另一方面,在延遲低氧的條件下,隨著HIF-1a轉(zhuǎn)錄活性的增加,HIF-1a自身可以形成一種負(fù)反饋環(huán)路(negativefeedback loop)來下調(diào)HIF-1a蛋白的表達(dá),該降解途徑是VHL和PHD非依賴的,而乙;揎棇τ谶@條負(fù)反饋環(huán)路的降解作用卻有著明顯的正相關(guān)性。與常氧條件下,E3泛素連接酶VHL調(diào)節(jié)HIF-1a的降解已經(jīng)廣為人知所不同的是,哪種E3泛素連接酶參與了延遲低氧中HIF-1a的降解還不清楚。 在本研究中,我們報導(dǎo)了作為一種與分子伴侶蛋白密切相關(guān)的E3泛素連接酶,CHIP參與了延遲低氧條件下HIF-1a的降解,同時還可以影響HIF-1a的轉(zhuǎn)錄活性,但對于HIF-1a的mRNA水平?jīng)]有影響。通過應(yīng)用p53和VHL缺失的細(xì)胞株以及RNA干擾實驗,我們證實了延遲低氧條件下,CHIP介導(dǎo)HIF-1a的降解途徑是VHL和p53/MDM2非依賴的。在延遲低氧的條件下,伴隨著HIF-1a蛋白水平的下降,HIF-1a的乙;揎椇头核鼗揎椂加兄黠@的增加,而CHIP可以通過與HIF-1a的直接結(jié)合,來促進(jìn)HIF-1a的泛素化狀態(tài),加速HIF-1a的降解。隨著低氧時間的延長,CHIP的表達(dá)水平有輕微的上調(diào),并可以從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi),實現(xiàn)與HIF-1a的共定位,從而介導(dǎo)HIF-1a的降解。通過蛋白酶體抑制劑MG132的應(yīng)用,我們發(fā)現(xiàn)了延遲低氧條件下,CHIP介導(dǎo)HIF-1a的降解是通過泛素蛋白酶體通路實現(xiàn)的。同時,我們還發(fā)現(xiàn)了組蛋白去乙;窰DAC1和HDAC2都參與了延遲低氧條件下HIF-1a的乙;揎。通過RNA干擾實驗和組蛋白去乙;敢种苿┑膽(yīng)用,我們發(fā)現(xiàn)了HDAC1和HDAC2的抑制可以導(dǎo)致HIF-1a乙;降脑黾,,增加CHIP和HIF-1a的直接結(jié)合,最終促進(jìn)CHIP介導(dǎo)HIF-1a的降解過程。通過對于CHIP的功能結(jié)構(gòu)域的分析,我們證實了其分子伴侶蛋白功能相關(guān)的TPR結(jié)構(gòu)域和E3泛素連接酶功能相關(guān)的U-box結(jié)構(gòu)域,不但對于CHIP介導(dǎo)的HIF-1a的降解都是必需的,而且對于CHIP抑制HIF-1a的轉(zhuǎn)錄激活功能也是必需的。通過對HIF-1a的功能結(jié)構(gòu)域的分析,我們證實了只有HIF-1a的野生型全長質(zhì)粒才可以被CHIP降解,而與乙;饔妹芮邢嚓P(guān)的ODD結(jié)構(gòu)域缺失體,或者只表達(dá)ODD結(jié)構(gòu)域及其乙;癁辄c突變體,最終都無法被CHIP所降解。通過我們的研究,對于目前如何區(qū)分低氧誘導(dǎo)因子家族成員的功能這一難題,提出了一個新的觀點。
【學(xué)位授予單位】:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2008
【分類號】:R341;R73-3

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