【摘要】： 腫瘤含氧量（tumor oxygenation）在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著巨大的作用。生理狀態(tài)下，絕大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞處于低氧狀態(tài)（hypoxia）并且發(fā)生許多功能性的改變。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）作為一種對氧氣敏感的轉(zhuǎn)錄因子超家族（transcription factor super family），主要負(fù)責(zé)眾多的低氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控。HIFs主要由三個成員組成：HIF-1、HIF-2（Endothelial PAS domain protein 1，EPAS1）和HIF-3（Inhibitory PAS protein，IPAS）�；罨腍IF是由HIF-αand HIF-β亞基構(gòu)成的異二聚體，前者是氧氣敏感的亞基，在常氧條件下極不穩(wěn)定；后者，也被稱作ARNT（arylhydrocarbon receptornuclear translocator）是組成性表達(dá)的。HIF-1α主要包含5個功能結(jié)構(gòu)域：bHLH（basichelix-loop-helix）、PAS（PER-ARNT-SIM）、NAD（N-terminal activation domain）、CAD（C-terminal activation domain）及ODD（oxygen-dependent degradation）結(jié)構(gòu)域。bHLH結(jié)構(gòu)域不僅對于HIF1與DNA的結(jié)合是必需的，同時還與PAS結(jié)構(gòu)域一起參與同HIF-1b亞基的結(jié)合。NAD和CAD結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，與NAD結(jié)構(gòu)域部分重疊的ODD結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)翻譯后修飾，對于HIF-1α的蛋白穩(wěn)定性具有重要的調(diào)節(jié)作用。 已知，HIF-1α蛋白ODD結(jié)構(gòu)域的兩個脯氨酸位點（Pro402和Pro564）可以被羥基化酶超家族PHDs（prolyl hydroxylase domain-containing proteins）羥基化修飾（hydroxylation）。羥基化修飾的HIF-1a蛋白易于與特異的E3泛素連接酶VHL（Von Hippel-Lindau）相結(jié)合，從而通過泛素蛋白酶體途徑降解，這也是低氧誘導(dǎo)因子HIF-1a蛋白在常氧下極不穩(wěn)定的主要因素。除了羥基化修飾，HIF-1a還可以進(jìn)行磷酸化（phosphorylation）、乙�；╝cetylation）和S-nitrosylation等修飾，這些不同的修飾狀態(tài)對HIF-1a的生物活性及穩(wěn)定性具有重要的影響。就乙�；�，ARD1（arrest-defective-1 protein）作為一種乙�；�，首先被發(fā)現(xiàn)可以在小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)乙�；疕IF-1a蛋白ODD結(jié)構(gòu)域的賴氨酸位點（Lys532），導(dǎo)致其蛋白水平的下降。然而，隨后的研究表明，過表達(dá)ARD1質(zhì)�；蛘吒蓴_內(nèi)源性ARD1的表達(dá)，在人腫瘤細(xì)胞中對于HIF-1a的蛋白穩(wěn)定性卻沒有任何影響。所以，在人腫瘤細(xì)胞中，何種乙�；附閷�(dǎo)HIF-1a的乙�；揎椖壳斑�不清楚。2007年末，通過酵母雙雜交的篩選，Semenza博士的研究小組于發(fā)現(xiàn)了兩個新型的乙�；窼SAT1和SSAT2（spermidine/spermine-N-acetyltransferase-1/2）參與了人腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1a蛋白的降解過程。雖然該研究小組沒有得到SSAT1或者SSAT2可以直接乙�；疕IF-a的證據(jù)，但其研究表明，SSAT1和SSAT2的乙�；富钚詫τ谄浣閷�(dǎo)HIF-1a的降解是必需的。另一方面，組蛋白去乙�；福╤istone deacetylases，HDACs）也被報道參與了HIF-1a蛋白可逆的乙�；揎�。HDAC1可以去乙�；疕IF-1a，阻止其進(jìn)入MTA1（metastasis-associated protein 1）調(diào)節(jié)的降解過程。另外，干擾HDAC4的表達(dá)可以增加HIF-1a的乙�；�，從而導(dǎo)致其降解。 CHIP（carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein），也被稱作STUB1（STIP1homology and U-box containing protein 1），是一種與分子伴侶蛋白（chaperones）功能密切相關(guān)的一類E3泛素連接酶。許多蛋白被報導(dǎo)了可以被CHIP通過泛素蛋白酶體途徑降解，例如ErbB2、p53、tau和ER等。CHIP主要包含3個功能結(jié)構(gòu)域：一個TPR（tetratricopeptide repeat）結(jié)構(gòu)域位于氨基端，其主要負(fù)責(zé)與熱休克蛋白Hsp90（heat shock protein 90）和熱休克結(jié)合蛋白Hsc70（heat shockcognate 70）結(jié)合，發(fā)揮其分子伴侶蛋白功能；一個U-box結(jié)構(gòu)域位于碳末端，其主要負(fù)責(zé)與降解底物結(jié)合，從而發(fā)揮其E3泛素連接酶功能；一個含有兩個潛在入核信號的linker位于中間，可能主要負(fù)責(zé)CHIP的細(xì)胞內(nèi)定位。作為Hsp90的底物蛋白，Hsp90對于維持HIF-1a的蛋白穩(wěn)定性具有重要的作用。在低氧條件下，當(dāng)Hsp90的功能受到抑制（如Hsp90抑制劑的應(yīng)用），HIF-1a與Hsp90分離，同時與RACK1（receptor for activated C kinase）結(jié)合，其介導(dǎo)HIF-1a通過VHL非依賴的泛素蛋白酶體通路降解。由于目前還未有報道是否RACK1具有E3泛素連接酶活性，所以何種E3泛素連接酶參與了這一過程，目前還不是很清楚。另一方面，已有的研究表明，CHIP蛋白的E3泛素連接酶功能主要與分子伴侶蛋白Hsp90和Hsc70密切相關(guān)。除此之外，CHIP的E3泛素連接酶功能還與E2泛素結(jié)合酶，UBC4/5超家族相關(guān)。由于UBC4/5超家族有著應(yīng)激激活（stress-activated）的特性，因此，在不同的應(yīng)激狀態(tài)下，CHIP有可能在分子伴侶復(fù)合物（chaperonecomplexes）到分子伴侶依賴的降解復(fù)合物的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要的作用。 在常氧的情況下，由于羥基化酶PHD和E3泛素連接酶VHL的存在，在人腫瘤細(xì)胞中，HIF-1a幾乎不表達(dá)；在低氧條件下，由于氧敏感的羥基化酶PHD的失活，導(dǎo)致了HIF-1a與E3泛素連接酶VHL的分離，從而HIF-1a可以穩(wěn)定地表達(dá)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。有趣的是，HIF-1a的表達(dá)在低氧的條件下也不是一成不變的：HIF-1a在嚴(yán)重低氧（severe hypoxia）或者延遲低氧（prolonged hypoxia）的條件下也可以發(fā)生不同程度的降解。在嚴(yán)重低氧（severe hypoxia）的情況下，p53蛋白可以通過抑制HIF-1a的轉(zhuǎn)錄活性，來降低HIF-1a的蛋白水平，而MDM2（murine double minutes 2）則以直接或者間接的方式參與p53調(diào)節(jié)的HIF-1a的降解。已有研究證明，在HepG2腫瘤細(xì)胞中，與急性低氧（acute hypoxia，5小時，1% O_2）處理相比較，延遲低氧處理（16小時，1% O_2）可以明顯地下調(diào)HIF-1a的蛋白水平；在A549腫瘤細(xì)胞中，HIF-1a同樣在急性低氧（4小時，0.5%O_2）條件下穩(wěn)定表達(dá)，但在延遲低氧的條件下，表達(dá)水平卻明顯地下降（6-12小時，0.5% O_2）。蛋白合成和蛋白降解同時參與了這一生理過程。一方面，延遲低氧可以抑制細(xì)胞蛋白合成調(diào)節(jié)者mTOR（mammalian target of rapamycin）的活性，通過抑制HIF-1a的蛋白合成來降低它的表達(dá)水平；另一方面，在延遲低氧的條件下，隨著HIF-1a轉(zhuǎn)錄活性的增加，HIF-1a自身可以形成一種負(fù)反饋環(huán)路（negativefeedback loop）來下調(diào)HIF-1a蛋白的表達(dá)，該降解途徑是VHL和PHD非依賴的，而乙�；揎棇τ谶@條負(fù)反饋環(huán)路的降解作用卻有著明顯的正相關(guān)性。與常氧條件下，E3泛素連接酶VHL調(diào)節(jié)HIF-1a的降解已經(jīng)廣為人知所不同的是，哪種E3泛素連接酶參與了延遲低氧中HIF-1a的降解還不清楚。 在本研究中，我們報導(dǎo)了作為一種與分子伴侶蛋白密切相關(guān)的E3泛素連接酶，CHIP參與了延遲低氧條件下HIF-1a的降解，同時還可以影響HIF-1a的轉(zhuǎn)錄活性，但對于HIF-1a的mRNA水平?jīng)]有影響。通過應(yīng)用p53和VHL缺失的細(xì)胞株以及RNA干擾實驗，我們證實了延遲低氧條件下，CHIP介導(dǎo)HIF-1a的降解途徑是VHL和p53/MDM2非依賴的。在延遲低氧的條件下，伴隨著HIF-1a蛋白水平的下降，HIF-1a的乙�；揎椇头核鼗揎椂加兄黠@的增加，而CHIP可以通過與HIF-1a的直接結(jié)合，來促進(jìn)HIF-1a的泛素化狀態(tài)，加速HIF-1a的降解。隨著低氧時間的延長，CHIP的表達(dá)水平有輕微的上調(diào)，并可以從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，實現(xiàn)與HIF-1a的共定位，從而介導(dǎo)HIF-1a的降解。通過蛋白酶體抑制劑MG132的應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)了延遲低氧條件下，CHIP介導(dǎo)HIF-1a的降解是通過泛素蛋白酶體通路實現(xiàn)的。同時，我們還發(fā)現(xiàn)了組蛋白去乙�；窰DAC1和HDAC2都參與了延遲低氧條件下HIF-1a的乙�；揎�。通過RNA干擾實驗和組蛋白去乙�；敢种苿┑膽�(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)了HDAC1和HDAC2的抑制可以導(dǎo)致HIF-1a乙�；降脑黾�，，增加CHIP和HIF-1a的直接結(jié)合，最終促進(jìn)CHIP介導(dǎo)HIF-1a的降解過程。通過對于CHIP的功能結(jié)構(gòu)域的分析，我們證實了其分子伴侶蛋白功能相關(guān)的TPR結(jié)構(gòu)域和E3泛素連接酶功能相關(guān)的U-box結(jié)構(gòu)域，不但對于CHIP介導(dǎo)的HIF-1a的降解都是必需的，而且對于CHIP抑制HIF-1a的轉(zhuǎn)錄激活功能也是必需的。通過對HIF-1a的功能結(jié)構(gòu)域的分析，我們證實了只有HIF-1a的野生型全長質(zhì)粒才可以被CHIP降解，而與乙�；饔妹芮邢嚓P(guān)的ODD結(jié)構(gòu)域缺失體，或者只表達(dá)ODD結(jié)構(gòu)域及其乙�；癁辄c突變體，最終都無法被CHIP所降解。通過我們的研究，對于目前如何區(qū)分低氧誘導(dǎo)因子家族成員的功能這一難題，提出了一個新的觀點。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R341;R73-3

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