【摘要】： 胰島移植或β細胞替代足糖尿病最理想的治療手段,但細胞來源嚴重匱乏及免疫排斥反應限制了臨床的廣泛應用。將人胚胎干細胞(human embryonicstem cell,hESCs)誘導為胰島素分泌細胞,成為β細胞替代物的新資源,為解決細胞來源匱乏帶來了希望。已有多種方案由ESCs獲得胰島素分泌細胞,但均存在各種限制,目前仍缺乏將ESCs誘導分化為有功能的胰島素分泌細胞的最佳方案。探索誘導人hSCs分化為成熟且有功能的胰島素分泌細胞,并制定出有效而高效的分化方案,成為本課題的主要研究目的。 第一,本研究摸索了在體外培養(yǎng)、擴增、凍存、復蘇hESCs細胞株(PKU1)的條件,并對其特異性標志物進行了檢測。結果顯示,hESCs經(jīng)多次傳代后仍然表達OCT-4和Nanog基因,免疫熒光法顯示呈OCT-4、SSEA-4陽性,流式細胞術分析顯示,OCT-4、SSEA-4陽性細胞比例分別達89.38%、83.44%;染色體核型分析表明為正常女性染色體核型(46,XX)。 第二,采用酶消化法分離出胎齡14-18W的胎兒胰島,經(jīng)懸浮培養(yǎng)、雙硫腙(DTZ)染色后種植到組織培養(yǎng)皿中,再以免疫熒光法檢測一些細胞標志物的表達。結果顯示,懸浮培養(yǎng)條件下,胎齡14-18W的胎兒胰島細胞聚集成球形細胞簇,呈DTZ陽性,培養(yǎng)液中能檢測到一定量的胰島素和C-肽,貼壁培養(yǎng)后還能檢測到胰島細胞標志物insulin和glucagons及前體細胞標志物PDX-1、CK-19和Nestin的表達,證實14-17W胎兒胰島已具備一定的胰島特性和前體細胞的特征。 第三,模擬胰腺發(fā)育分化的生理過程,研究設計出五階段誘導方案,具體如下:(1).撤除分化抑制因素使hESCs形成擬胚體(EBs),懸浮培養(yǎng)48h;(2).將EBs轉移至明膠包被的組織培養(yǎng)皿后,加入含Activin A和bFGF及LY294002的誘導培養(yǎng)基Ⅰ誘導5天,向定形內胚層誘導分化。RT-PCR法鑒定SOX17和FOXA2的基因表達,與同期自發(fā)分化的EBs進行比較,免疫熒光法檢測SOX17的表達。(3).將細胞轉移至laminin包被的培養(yǎng)皿,加入含bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清誘導培養(yǎng)基Ⅱ作用14d,向胰腺前體細胞誘導。RT-PCR法和免疫熒光化學法分別檢測前體細胞標志物PDX-1及Ngn3表達。(4).添加含IGF-1、betacellulin、尼克酰胺、GLP-1、laminin的低血清誘導培養(yǎng)基Ⅲ作用14d,促進胰島細胞分化,RT-PCR法檢測細胞胰島素基因的表達,免疫熒光化學法檢測分化細胞胰島素和C-肽的表達。(5).將細胞轉移至低黏附性培養(yǎng)皿中,撤除IGF-I繼續(xù)培養(yǎng)3天,促進細胞成熟。應用雙硫腙(DTZ)染色液對獲得的細胞團進行染色,應用RT-PCR法檢測了胰島素和胰高血糖素基因表達,應用RIA法分別測定了獲得的細胞團培養(yǎng)液上清和胞漿中的胰島素、C-肽含量,并與胎兒胰島培液上清進行比較,靜態(tài)培養(yǎng)胰島素釋放試驗測定胰島素與C-肽分泌是否呈葡萄糖反應性。結果(1).hESCs懸浮培養(yǎng)2d后,形成類球形EBs;(2).經(jīng)第二階段誘導后,細胞表達SOX17和FOXA2基因,且表達量高于同期自發(fā)分化的EBs,基本不表達外胚層標志物SOX1,隨誘導時間延長,FOXA2表達逐漸增強;免疫熒光化學法顯示,誘導5天的細胞胞核呈SOX17。(3).經(jīng)第三階段的誘導,細胞呈上皮樣集落,RT-PCR法檢測到細胞表達PDX-1、Ngn3及微弱的Pax4基因,免疫熒光法顯示細胞呈PDX-1陽性。(4)經(jīng)第四階段的誘導,集落中一部分細胞聚集成多層,RT-PCR顯示,不同誘導時期均有胰島素基因的表達,且隨誘導時間延長表達水平逐漸升高;免疫熒光顯示,部分細胞呈胰島素和C-肽陽性。(5).經(jīng)第五階段誘導后,hESCs來源的細胞呈類似胎兒胰島的胰島樣細胞簇(ICCs),呈DTZ陽性,RT-PCR檢測到Insulin和Glucagon基因表達,RIA法檢測到ICCs培液上清中含胰島素與C-肽,水平與15-17W胎兒胰島培液上清相近(P＞0.05),胞漿內的胰島素和C-肽水平分別為1089.2±217.06μIU/ml和181.33±30.12ng/ml,靜態(tài)培養(yǎng)胰島素釋放試驗驗證了ICCs分泌的胰島素呈糖反應性。 應用五階段分化方案,hESCs能夠有效的分化為具有部分β細胞特性和糖反應性胰島素分泌功能的細胞,為DM細胞替代治療提供了有潛力的細胞來源和良好的臨床應用前景。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329;R587.1

【參考文獻】

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1 王�；�;陳兵;張平;王富華;蔡紅衛(wèi);;人胎胰島細胞的分離培養(yǎng)及其意義[J];重慶醫(yī)學;2006年09期

2 賈延R，

本文編號：2526642