發(fā)布時(shí)間：2019-08-14 15:15

【摘要】： 胰島移植或β細(xì)胞替代足糖尿病最理想的治療手段,但細(xì)胞來源嚴(yán)重匱乏及免疫排斥反應(yīng)限制了臨床的廣泛應(yīng)用。將人胚胎干細(xì)胞(human embryonicstem cell,hESCs)誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞,成為β細(xì)胞替代物的新資源,為解決細(xì)胞來源匱乏帶來了希望。已有多種方案由ESCs獲得胰島素分泌細(xì)胞,但均存在各種限制,目前仍缺乏將ESCs誘導(dǎo)分化為有功能的胰島素分泌細(xì)胞的最佳方案。探索誘導(dǎo)人hSCs分化為成熟且有功能的胰島素分泌細(xì)胞,并制定出有效而高效的分化方案,成為本課題的主要研究目的。 第一,本研究摸索了在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、凍存、復(fù)蘇hESCs細(xì)胞株(PKU1)的條件,并對(duì)其特異性標(biāo)志物進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,hESCs經(jīng)多次傳代后仍然表達(dá)OCT-4和Nanog基因,免疫熒光法顯示呈OCT-4、SSEA-4陽性,流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,OCT-4、SSEA-4陽性細(xì)胞比例分別達(dá)89.38%、83.44%;染色體核型分析表明為正常女性染色體核型(46,XX)。 第二,采用酶消化法分離出胎齡14-18W的胎兒胰島,經(jīng)懸浮培養(yǎng)、雙硫腙(DTZ)染色后種植到組織培養(yǎng)皿中,再以免疫熒光法檢測(cè)一些細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示,懸浮培養(yǎng)條件下,胎齡14-18W的胎兒胰島細(xì)胞聚集成球形細(xì)胞簇,呈DTZ陽性,培養(yǎng)液中能檢測(cè)到一定量的胰島素和C-肽,貼壁培養(yǎng)后還能檢測(cè)到胰島細(xì)胞標(biāo)志物insulin和glucagons及前體細(xì)胞標(biāo)志物PDX-1、CK-19和Nestin的表達(dá),證實(shí)14-17W胎兒胰島已具備一定的胰島特性和前體細(xì)胞的特征。 第三,模擬胰腺發(fā)育分化的生理過程,研究設(shè)計(jì)出五階段誘導(dǎo)方案,具體如下:(1).撤除分化抑制因素使hESCs形成擬胚體(EBs),懸浮培養(yǎng)48h;(2).將EBs轉(zhuǎn)移至明膠包被的組織培養(yǎng)皿后,加入含Activin A和bFGF及LY294002的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ誘導(dǎo)5天,向定形內(nèi)胚層誘導(dǎo)分化。RT-PCR法鑒定SOX17和FOXA2的基因表達(dá),與同期自發(fā)分化的EBs進(jìn)行比較,免疫熒光法檢測(cè)SOX17的表達(dá)。(3).將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至laminin包被的培養(yǎng)皿,加入含bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ作用14d,向胰腺前體細(xì)胞誘導(dǎo)。RT-PCR法和免疫熒光化學(xué)法分別檢測(cè)前體細(xì)胞標(biāo)志物PDX-1及Ngn3表達(dá)。(4).添加含IGF-1、betacellulin、尼克酰胺、GLP-1、laminin的低血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ作用14d,促進(jìn)胰島細(xì)胞分化,RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞胰島素基因的表達(dá),免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)分化細(xì)胞胰島素和C-肽的表達(dá)。(5).將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低黏附性培養(yǎng)皿中,撤除IGF-I繼續(xù)培養(yǎng)3天,促進(jìn)細(xì)胞成熟。應(yīng)用雙硫腙(DTZ)染色液對(duì)獲得的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行染色,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)了胰島素和胰高血糖素基因表達(dá),應(yīng)用RIA法分別測(cè)定了獲得的細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)液上清和胞漿中的胰島素、C-肽含量,并與胎兒胰島培液上清進(jìn)行比較,靜態(tài)培養(yǎng)胰島素釋放試驗(yàn)測(cè)定胰島素與C-肽分泌是否呈葡萄糖反應(yīng)性。結(jié)果(1).hESCs懸浮培養(yǎng)2d后,形成類球形EBs;(2).經(jīng)第二階段誘導(dǎo)后,細(xì)胞表達(dá)SOX17和FOXA2基因,且表達(dá)量高于同期自發(fā)分化的EBs,基本不表達(dá)外胚層標(biāo)志物SOX1,隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),FOXA2表達(dá)逐漸增強(qiáng);免疫熒光化學(xué)法顯示,誘導(dǎo)5天的細(xì)胞胞核呈SOX17。(3).經(jīng)第三階段的誘導(dǎo),細(xì)胞呈上皮樣集落,RT-PCR法檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)PDX-1、Ngn3及微弱的Pax4基因,免疫熒光法顯示細(xì)胞呈PDX-1陽性。(4)經(jīng)第四階段的誘導(dǎo),集落中一部分細(xì)胞聚集成多層,RT-PCR顯示,不同誘導(dǎo)時(shí)期均有胰島素基因的表達(dá),且隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)水平逐漸升高;免疫熒光顯示,部分細(xì)胞呈胰島素和C-肽陽性。(5).經(jīng)第五階段誘導(dǎo)后,hESCs來源的細(xì)胞呈類似胎兒胰島的胰島樣細(xì)胞簇(ICCs),呈DTZ陽性,RT-PCR檢測(cè)到Insulin和Glucagon基因表達(dá),RIA法檢測(cè)到ICCs培液上清中含胰島素與C-肽,水平與15-17W胎兒胰島培液上清相近(P＞0.05),胞漿內(nèi)的胰島素和C-肽水平分別為1089.2±217.06μIU/ml和181.33±30.12ng/ml,靜態(tài)培養(yǎng)胰島素釋放試驗(yàn)驗(yàn)證了ICCs分泌的胰島素呈糖反應(yīng)性。 應(yīng)用五階段分化方案,hESCs能夠有效的分化為具有部分β細(xì)胞特性和糖反應(yīng)性胰島素分泌功能的細(xì)胞,為DM細(xì)胞替代治療提供了有潛力的細(xì)胞來源和良好的臨床應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329;R587.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 王�；�;陳兵;張平;王富華;蔡紅衛(wèi);;人胎胰島細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其意義[J];重慶醫(yī)學(xué);2006年09期

2 賈延R，

本文編號(hào)：2526642