【摘要】：【研究背景】 隨著人口的老齡化,女性盆底功能障礙性疾病(Pelvic floor dysfunctional diseases PFD)的發(fā)病率逐年升高,是中老年婦女的常見疾病。女性盆底是由肌肉群、筋膜、韌帶及其神經(jīng)構(gòu)成的支持系統(tǒng)。其互相作用和支持,承托并保持子宮、膀胱和直腸等盆腔臟器于正常位置。膠原蛋白則是韌帶和筋膜這些支持結(jié)構(gòu)的主要成分,對維持盆底支持組織的彈性和韌性起重要作用。研究表明,人體中有21種膠原蛋白分子。盆底筋膜及韌帶主要是由I型膠原蛋白組成。I型膠原直徑較粗,有很高的抗張強(qiáng)度,起支持作用。隨著年齡的增長及其它相關(guān)病因的發(fā)生,人體內(nèi)筋膜和韌帶中成纖維細(xì)胞的增殖及表達(dá)I型膠原蛋白的能力逐漸降低,相關(guān)膠原含量的減少導(dǎo)致了韌帶、筋膜等解剖結(jié)構(gòu)張力降低,導(dǎo)致支持結(jié)構(gòu)的松弛,最終導(dǎo)致盆底功能障礙性疾病(PFD)的發(fā)生【1】。 應(yīng)用補片對盆底缺陷進(jìn)行修復(fù)是目前治療盆底功能障礙性疾病(PFD)的重要方法,常用的補片包括人工合成材料和生物補片材料,國內(nèi)、國外文獻(xiàn)報道人工合成補片具有侵蝕(erosion)并發(fā)癥,發(fā)生率約13%-26%不等【2】【3】,而生物補片雖然具有生物相容性好、侵蝕率低等優(yōu)點,但植入人體后的降解問題一直是臨床上爭論的焦點,其6個月后的降解率高達(dá)40%【4】。因此,尋找新的替代材料,是減少盆底重建手術(shù)并發(fā)癥和降低術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。 干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。干細(xì)胞的主要特征是能無限分裂增殖。2001年,Zuk【5】等首次從人脂肪組織中分離獲得一群具有多向分化潛能的細(xì)胞——即脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)。脂肪源性干細(xì)胞的主要優(yōu)點是:1、來源豐富,取材方便,對人體無創(chuàng)傷;2、干細(xì)胞豐度高,少量的脂肪組織即可獲得足夠脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs);3、較易培養(yǎng),相較于其它種類的干細(xì)胞,脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)的培養(yǎng)要求相對較低;4、分裂增殖能力旺盛,脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)是目前生長最快的干細(xì)胞。因此脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)具有很好的臨床運用前景。 【研究目的】 1、探討ADSCs的分離培養(yǎng)的實驗方法,為干細(xì)胞實驗方法學(xué)提供依據(jù)。 2、運用ADSCs與大鼠筋膜成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)的方法,探討其對ADSCs表達(dá)I型膠原蛋白的影響。從而尋找能夠替代衰老或損傷的盆底成纖維細(xì)胞并有效表達(dá)膠原蛋白的種子細(xì)胞,為盆底功能障礙性疾病提供新的治療途徑。 【研究方法】 1、用成年SD大鼠,雌雄不限,體重約為220-250g,取大鼠腹股溝側(cè)的脂肪組織,消化分離后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取原代細(xì)胞分別以1×104/ml;1×106/ml;1×108/ml的細(xì)胞濃度接種,在1-7天后用MTT法檢測。用MTT法對1-13代細(xì)胞進(jìn)行生長曲線的測定,并對第4代細(xì)胞行HE染色及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。 2、取第4代細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記物CD105、CD106、CD44、CD49d檢測,進(jìn)行ADSCs鑒定。 3、取經(jīng)鑒定的ADSCs和自體來源的大鼠筋膜成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng),在不同時間段取ADSCs用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測其I型膠原蛋白的表達(dá)。 【結(jié)果】 1、形成大量漩渦狀或長梭狀細(xì)胞集落,細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44, CD106,CD105,CD49d陽性率分別為99.59%,0.85%,95.00%,89.56%。 2、MTT繪制生長曲線顯示大鼠脂肪源性干細(xì)胞經(jīng)多次傳代后細(xì)胞仍能保持較強(qiáng)的分裂增殖能力。體外培養(yǎng)第1、3、5、7代脂肪源性干細(xì)胞在1-2天處于潛伏期及緩慢增長期,第3天進(jìn)入對數(shù)生長期,第4天后進(jìn)入平臺期,細(xì)胞生長曲線呈“S”形。第9-13代脂肪源性干細(xì)胞在第1-4天都處于潛伏期及緩慢增長期,第5-6天才進(jìn)入對數(shù)生長期,第7天達(dá)到平臺期,細(xì)胞生長曲線呈“S”形。 3、以1×104/ml原代細(xì)胞密度接種時,其生長曲線顯示:在體外培養(yǎng)1-3天處于潛伏期、第3-4天進(jìn)入緩慢增長期,第4-6天為對數(shù)生長期,第7天后進(jìn)入平臺期。以1×106/ml原代細(xì)胞密度接種時,其生長曲線顯示在體外培養(yǎng)1-2天處于潛伏期、第2-3天為緩慢增長期,第3-5天進(jìn)入對數(shù)生長期,第6天后進(jìn)入平臺期。以1×108/ml原代細(xì)胞密度接種時,其生長曲線顯示在體外培養(yǎng)1-2天處于潛伏期、第2-3天為緩慢增長期,第3-4天進(jìn)入對數(shù)生長期,第5天后進(jìn)入平臺期。細(xì)胞生長曲線呈“S”形。 4、HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)顯示:第4代脂肪源性干細(xì)胞行HE染色后可見圓形細(xì)胞核呈紫色,核內(nèi)見粗顆粒狀染色質(zhì),胞漿呈淡紅色。細(xì)胞呈長梭狀或多角狀。 5、與筋膜來源的成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)3天、5天、7天的實驗組較對照組I型膠原蛋白含量顯著增加有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。實驗組中共培養(yǎng)5天、7天與3天比較I型膠原蛋白含量增加有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),實驗組中共培養(yǎng)7天與5天比較I型膠原蛋白含量增加無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 【結(jié)論】 1、本實驗成功分離培養(yǎng)的大鼠脂肪源性干細(xì)胞,其表面標(biāo)志物CD44,CD105,CD49d表達(dá)陽性,CD106表達(dá)陰性,但仍需進(jìn)一步進(jìn)行干細(xì)胞誘導(dǎo)實驗加以證實。 2、在一定范圍內(nèi),不同的干細(xì)胞接種密度會影響脂肪源性干細(xì)胞的分裂增殖。本實驗證實以1×106/ml的ADSCs密度接種,細(xì)胞能較早進(jìn)入對數(shù)生長期,且對數(shù)生長期持續(xù)時間最長。該細(xì)胞株持續(xù)至第13代仍然能夠保持旺盛的分裂增殖能力及形態(tài)特性。 3、ADSCs與筋膜成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)后,ADSCs表達(dá)I型膠原蛋白的含量增加。說明ADSCs與筋膜成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)能促進(jìn)ADSCs合成I型膠原蛋白,提示ADSCs可能運用于替代損傷或老化的盆底筋膜組織,但仍需進(jìn)行體內(nèi)試驗證實。
【圖文】：

原代ADSCs接種時（10x10）

原代ADSCs接種7小時后（10x40）
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄧春華;孫祥宙;高勇;羅道升;劉貴華;黃燕平;;大鼠脂肪組織來源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究[J];中華男科學(xué)雜志;2008年02期

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本文編號：2524425