發(fā)布時(shí)間：2019-08-06 07:48

【摘要】： 目的本研究旨在建立一種從新鮮冰凍血漿中提取凝血因子V(Coagulation factor V,FV)的方法,并用提取的FV為抗原免疫小鼠,以建立抗人FV單克隆抗體細(xì)胞株,為利用FV單克隆抗體研制FV檢測(cè)試劑做準(zhǔn)備。 方法(1)通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)溫度、時(shí)間和加入血漿中的酶抑制劑的選擇,探索能夠保持FV穩(wěn)定的純化條件;采用檸檬酸鋇吸附、聚乙二醇6000分級(jí)沉淀,對(duì)血漿進(jìn)行預(yù)處理,獲得富集FV的血漿;通過(guò)DEAE-Sepharose FF離子交換層析提取FV;利用Sephacryl-S300凝膠過(guò)濾層析獲得純度較高的FV;超濾濃縮后加保存液凍存。(2)以純化的人FV為抗原免疫BALB/c小鼠,將免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,HAT選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng);用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)篩選出抗人FV陽(yáng)性細(xì)胞株,對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆并進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析,篩選可穩(wěn)定分泌FV單克隆抗體細(xì)胞株。 結(jié)果-80℃存放的新鮮冰凍血漿轉(zhuǎn)4℃放置5h,37℃水浴快速融化后再轉(zhuǎn)至4℃,添加蛋白酶抑制劑,整個(gè)純化過(guò)程控制在4℃進(jìn)行,能較好的保持FV的穩(wěn)定和回收率。電泳圖譜顯示:添加二異丙基氟磷酸(DFP)要比未加DFP獲得的未降解FV多。經(jīng)過(guò)對(duì)血漿預(yù)處理和兩步層析后,FV活性回收率為11.21±3.54%,比活性為30.46±0.31U/mg,濃縮倍數(shù)為2538.33±25.83倍。初步建立起4株分泌抗人FV的單克隆抗體細(xì)胞株,命名為AFV 001～004。 結(jié)論①本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的純化方法能夠較有效的濃縮人血漿中的FV,并制備出較高純度的FV;②初步建立起抗人FV的單克隆抗體細(xì)胞株。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2523419