【摘要】： 研究背景和研究目的 1.損傷識(shí)別機(jī)制的不同是轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)和泛基因組修復(fù)途徑的主要區(qū)別核苷酸切除修復(fù)途徑(NER)是DNA修復(fù)途徑中最靈活的一種,它可以修復(fù)多個(gè)結(jié)構(gòu)上不連續(xù)的DNA損傷。該系統(tǒng)的作用需要包括XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG與ERCC1在內(nèi)的至少17種酶或蛋白質(zhì)的活力。在NER中,限速步驟為DNA損傷的識(shí)別/切除。 NER可分為兩種亞途徑:①泛基因組修復(fù)(Global genome repair,GGR)。②轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)(Transcription-coupled repair TCR)。這兩種途徑在開(kāi)始部分有所不同,GGR作用于DNA的非轉(zhuǎn)錄區(qū),TCR作用于活性轉(zhuǎn)錄區(qū),一旦啟動(dòng)則兩者利用的酶一樣。如果損傷發(fā)生在DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈,則發(fā)生泛基因組修復(fù),XPC/hHR23B復(fù)合物的形成是NER損傷識(shí)別的起始階段。如果損傷發(fā)生在轉(zhuǎn)錄鏈上的活性基因部位,則發(fā)生轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù),起轉(zhuǎn)錄作用的RNA聚合酶Ⅱ被阻滯,是導(dǎo)致TCR的迅速起始信號(hào)。在此過(guò)程中,一些錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程中的蛋白CSA和CSB (CS,Cockayne syndrome,凱恩綜合征)是必需的,CSA和CSB可能在使停滯的RNA聚合酶Ⅱ移動(dòng)上起作用,以允許有足夠的空間完成NER。這種修復(fù)比GGR迅速且效率也較高。 2.順鉑和UV介導(dǎo)的DNA損傷理論上均可介導(dǎo)TCR的發(fā)生 在眾多外源性DNA損傷因素中,以順鉑(cisplatin)和紫外輻射研究的最多(UV)。順鉑形成鏈內(nèi)加合物(Pt-DNA)及DNA交聯(lián)(DNA-crosslink)而損傷DNA,阻止DNA復(fù)制,其中1-2鏈內(nèi)交聯(lián)占90%以上,少數(shù)為1-3鏈內(nèi)交聯(lián)。紫外線照射主要導(dǎo)致環(huán)丁烷嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimers,CPDs)和6-4光產(chǎn)物的形成損害DNA。紫外輻射引起DNA損傷的根本原因在于其能誘發(fā)DNA同條鏈內(nèi)相鄰的嘧啶堿基產(chǎn)生嘧啶二聚體,使DNA空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而阻礙了DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的生物功能。順鉑和UV介導(dǎo)的DNA損傷共同點(diǎn)在于均可導(dǎo)致DNA鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián),使DNA雙螺旋的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,阻礙DNA的轉(zhuǎn)錄,理論上均可介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)途徑的發(fā)生。 3.順鉑和UV介導(dǎo)的TCR和突變發(fā)生的關(guān)系缺少正常細(xì)胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)證據(jù) 已有的體外研究表明,UV導(dǎo)致的CPDs損傷在可表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄鏈上的修復(fù)比在非轉(zhuǎn)錄鏈上要迅速得多。相反,在可表達(dá)序列和非表達(dá)序列上的6-4光化合產(chǎn)物均能得以充分清除;順鉑導(dǎo)致的1-2鏈內(nèi)交聯(lián)在體外實(shí)驗(yàn)中亦可誘導(dǎo)TCR的發(fā)生,在人類細(xì)胞的核裂解液中發(fā)現(xiàn),1-3鏈間交鏈同樣可阻滯RNAPⅡ的轉(zhuǎn)錄作用。目前對(duì)UV和順鉑DNA損傷的細(xì)胞內(nèi)研究主要以缺陷細(xì)胞為工具,如GGR缺陷細(xì)胞XPA、XPC等,TCR缺陷細(xì)胞CSA、CSB等,利用缺陷細(xì)胞內(nèi)GGR或者TCR途徑缺失的特點(diǎn),可以單獨(dú)研究某一種修復(fù)途徑的分子機(jī)制,但缺陷細(xì)胞總體的DNA修復(fù)功能是不健全的,相對(duì)于正常細(xì)胞,不能真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)生理狀態(tài)下修復(fù)和突變的發(fā)生情況。 4.如何在同一種細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)GGR途徑和TCR途徑的單獨(dú)作用是在正常細(xì)胞內(nèi)研究TCR與突變分子機(jī)制的關(guān)鍵問(wèn)題。 HEK293細(xì)胞內(nèi)的各種修復(fù)途徑均正常,DNA受到機(jī)體內(nèi)外各種因素的損傷后,細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)包括TCR和GGR在內(nèi)的各種途徑進(jìn)行修復(fù),突變的產(chǎn)生是各種修復(fù)途徑綜合作用的結(jié)果。為了實(shí)現(xiàn)在同一種細(xì)胞內(nèi)GGR和TCR途徑的單獨(dú)作用,需要設(shè)計(jì)一種可控的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄模型,通過(guò)人為控制報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)途徑的啟動(dòng),從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)和泛基因組修復(fù)的分離。 5.本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路和研究目的 ①突變研究實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì) 四環(huán)素正調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng),稱為Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)。理論上在沒(méi)有四環(huán)素的情況下目的基因表達(dá)水平為零,而在加入四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素(doxycycline,Dox)后目的基因高效表達(dá)。SupF基因所編碼的tRNA,能識(shí)別宿主菌lacZ基因的琥珀型突變,產(chǎn)生正常的β-半乳糖苷酶,在含β-半乳糖苷酶底物X-gal和lac操縱子誘導(dǎo)物IPTG以及相應(yīng)抗性的LB指示平板上,其菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)SupF基因發(fā)生突變,影響或完全喪失其所編碼的tRNA功能時(shí),其菌落呈現(xiàn)淡藍(lán)色或白色。本實(shí)驗(yàn)中,我們將Tet-on基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)和SupF tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相結(jié)合,構(gòu)建了一種可控轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。以SupF為損傷靶基因,UVC和順鉑體外損傷后,轉(zhuǎn)入Tet-on293細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)和擴(kuò)增,最后轉(zhuǎn)化細(xì)菌挑取白色突變克隆,突變子DNA測(cè)序分析,來(lái)確定突變形成的分子機(jī)制和突變發(fā)生的冷熱點(diǎn)。 ②本實(shí)驗(yàn)的研究目的 綜合目前轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的研究進(jìn)展,本課題主要圍繞轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)在順鉑和UV導(dǎo)致的DNA損傷和突變過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行研究,擬通過(guò)基因重組、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、定標(biāo)性突變研究、藍(lán)白斑篩選、DNA測(cè)序等技術(shù),在分子水平探討下面幾個(gè)問(wèn)題:①在同一細(xì)胞內(nèi)如何實(shí)現(xiàn)GGR與TCR途徑單獨(dú)作用;②UV和順鉑造成的DNA損傷能否誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)途徑的發(fā)生;③UV和順鉑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)過(guò)程中報(bào)告基因突變頻譜的特點(diǎn);④轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)途徑介導(dǎo)突變發(fā)生的可能分子機(jī)制; 方法: 1.雙向啟動(dòng)、雙報(bào)告基因的穿梭質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc構(gòu)建及鑒定 以Tet-on反應(yīng)質(zhì)粒pBI-L為載體,插入來(lái)源于質(zhì)粒pSupF-G1的突變報(bào)告基因SupF片斷,再設(shè)計(jì)一段引物,從質(zhì)粒pEGFP-1擴(kuò)增SV40 ori/Kan/Neo片斷,合適的酶切處理后,與已經(jīng)亞克隆一次的載體質(zhì)粒連接,最終得到目的質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc,并通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序分析等手段驗(yàn)證插入序列的位置和堿基順序的正確性,為下一步研究提供敏感、可靠的實(shí)驗(yàn)工具。 2. Tet-on調(diào)控的SupF tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的建立和功能驗(yàn)證 完整的Tet控制系統(tǒng)由Tet調(diào)節(jié)質(zhì)粒和Tet反應(yīng)質(zhì)粒構(gòu)成,Tet-on293細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Tet調(diào)節(jié)質(zhì)粒pTET-ON質(zhì)粒的人HEK293細(xì)胞,在本實(shí)驗(yàn)中作為調(diào)節(jié)系統(tǒng),已經(jīng)構(gòu)建并測(cè)序驗(yàn)證后的pTCR-SupF-Luc為反應(yīng)系統(tǒng)。培養(yǎng)Tet-on293細(xì)胞,陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pTCR-SupF-Luc瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Tet-on293細(xì)胞,8 h后更換完全培養(yǎng)液,加入終濃度為1μg/ml的強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄,48h后檢測(cè)Luciferase基因表達(dá)情況驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄是否得以進(jìn)行。裂解細(xì)胞,提取質(zhì)粒,純化后轉(zhuǎn)化專用菌SY204驗(yàn)證SupF報(bào)告基因活性。 3. UVC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)與突變發(fā)生分子機(jī)制的研究 UVC(波長(zhǎng)254nm的短波紫外線)體外損傷pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒,劑量為1500J/M2,損傷后的質(zhì)粒陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Tet-on293細(xì)胞,細(xì)胞分為加藥組和對(duì)照組,8h后更換完全培養(yǎng)液,加藥組加入終濃度1μg/ml的DOX,各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h,使質(zhì)粒得以充分復(fù)制和修復(fù)。取部分細(xì)胞,裂解后測(cè)Luciferase基因表達(dá)情況,若明顯升高說(shuō)明SupF報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄已經(jīng)啟動(dòng),裂解剩余細(xì)胞,提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化SY204細(xì)菌,通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取白色突變克隆,計(jì)算突變頻率=突變的白色菌落數(shù)/總菌落數(shù)。擴(kuò)增后測(cè)序獲得突變頻譜,分別對(duì)轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的突變情況進(jìn)行對(duì)比,分析UVC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)過(guò)程中突變產(chǎn)生的分子機(jī)制。 4. TCR在順鉑導(dǎo)致的SupF基因損傷和突變發(fā)生中的作用機(jī)制研究 pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒100μg,加入終濃度50uM的順鉑溶液,總體積200μl,室溫下放置4h,使質(zhì)粒充分染毒,形成DNA交聯(lián)。酚:氯仿抽提,無(wú)水乙醇沉淀得到純化質(zhì)粒,陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Tet-on293細(xì)胞,進(jìn)行定標(biāo)性突變研究,通過(guò)細(xì)菌的藍(lán)白斑篩選挑取突變克隆確定突變頻率和DNA測(cè)序,分別測(cè)定轉(zhuǎn)錄與非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下SupF的突變特點(diǎn),分析轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)在順鉑致突變過(guò)程中的作用機(jī)制。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建了雙向啟動(dòng)、雙報(bào)告基因的穿梭質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc,經(jīng)過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證,確定插入片斷的位置符合設(shè)計(jì)要求,堿基序列與來(lái)源序列同源性100%。 2.將Tet-on293細(xì)胞與pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒相結(jié)合,建立了Tet-on調(diào)控的SupF tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),經(jīng)過(guò)Luciferase基因檢測(cè)和SupF基因活性測(cè)定,證明了該系統(tǒng)的可控性和敏感性,本系統(tǒng)的具有以下特點(diǎn):①SupF突變報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)Tet-on系統(tǒng)精確調(diào)控;②雙報(bào)告基因:Luciferase基因、SupF基因,通過(guò)檢測(cè)Luciferase基因的表達(dá)可以明確SupF基因是否得以轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而明確是否誘發(fā)TCR途徑;③穿梭質(zhì)粒,pTCR-SupF-Luc質(zhì)粒中含有原核細(xì)胞復(fù)制子Col E1和真核細(xì)胞復(fù)制子SV40ori,可以在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存活和復(fù)制,使得在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)生的遺傳學(xué)事件,能很方便地在細(xì)菌中得到報(bào)道;④SupF基因很小,遺傳背景清楚,通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)定位突變熱點(diǎn)及上下游序列變得相對(duì)容易。 3.得到SupF突變報(bào)告基因由UVC誘導(dǎo)的在不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下的突變頻率和突變頻譜。TCR途徑,SupF基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄,突變頻率為2.2%,突變熱點(diǎn)集中在5’-CG-3’、5’-CC-3’、5’-TC-3’區(qū)域;GGR途徑,SupF基因轉(zhuǎn)錄沉默,突變頻率為1.2%,突變熱點(diǎn)集中在5’-GGGGGGG-3’、5’-CC-3’、5’-TT-3’區(qū)域。突變頻譜見(jiàn)下表所示。 4.得到順鉑誘導(dǎo)的SupF基因在不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下的突變頻率和突變頻譜,TCR途徑,SupF基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄,突變頻率為1.45%,突變熱點(diǎn)集中在5’-CG- 3’、5’-GCCG-3’區(qū)域;GGR途徑,SupF基因轉(zhuǎn)錄沉默,突變頻率為1.20%,突變熱點(diǎn)集中在5’-GGGGGGG-3’、5’-GGGA-3’、5’-GAAG-3’區(qū)域。突變頻譜見(jiàn)下表所示。 結(jié)論 1.本研究成功構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)研究的雙向轉(zhuǎn)錄、雙報(bào)告基因的Tet-on反應(yīng)質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc。 2.本研究利用Tet-on293細(xì)胞和重組質(zhì)粒pTCR-SupF-Luc組成可控的SupF報(bào)告基因定標(biāo)性突變研究系統(tǒng),經(jīng)功能驗(yàn)證符合理論預(yù)期,為研究轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)與突變發(fā)生的分子機(jī)制提供理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?3.在正常人類細(xì)胞內(nèi)報(bào)道了轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)參與UVC和順鉑介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過(guò)程。 4. UVC介導(dǎo)的CPDs損傷(環(huán)丁烷嘧啶二聚體)和順鉑導(dǎo)致的cis-1.3-d(GTG)鏈內(nèi)交聯(lián)主要由TCR優(yōu)先修復(fù)。 5.首次在SupF基因中確定了正常細(xì)胞TCR和GGR兩種修復(fù)狀態(tài)下突變頻譜的特征性差異。 6.通過(guò)對(duì)突變頻譜的分析發(fā)現(xiàn),在UV和順鉑介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過(guò)程中,TCR和GGR有著不同的“突變指紋”,提示TCR在修復(fù)兩種損傷過(guò)程中存在序列依賴性,兩種NER修復(fù)途徑對(duì)維持基因組遺傳穩(wěn)定性可能起不同而又互補(bǔ)的作用。
【圖文】：

pBI-L質(zhì)粒圖譜

pEGFP-1質(zhì)粒圖譜
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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6 郭新軍;擬黑多刺蟻肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2與肌鈣蛋白Ⅰ亞基基因的克隆及其在發(fā)育中的表達(dá)研究[D];陜西師范大學(xué);2010年

7 生書晶;何首烏芪合酶基因（FmSTS）的克隆、鑒定及轉(zhuǎn)化擬南芥研究[D];華南理工大學(xué);2010年

8 梁東;蘋果山梨醇代謝相關(guān)基因的分子特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

9 朱彥濤;甘藍(lán)型油菜Polima CMS和陜2A CMS的形態(tài)和生化特征及其胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的比較研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

10 溫武軍;鯉抗菌肽基因的克隆及其功能研究[D];山東師范大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 高紅梅;ETEC對(duì)斷奶腹瀉仔豬胃腸道緊密連接蛋白ZO-1的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 王樹(shù)云;斑點(diǎn)叉尾洶病毒ORF6和ORF10基因的原核表達(dá)及其功能的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 汪艷杰;水稻polycomb基因家族甲基化狀態(tài)初步檢測(cè)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 王偉;惡臭假單胞菌表面展示細(xì)菌漆酶及對(duì)染料的脫色性能[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 黃輝;哈維弧菌表面抗原的克隆和真核表達(dá)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

6 段龍川;產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌重組沙門氏菌基因工程疫苗的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

7 龔瑞;粘附素ClfA和Cna對(duì)金黃色葡萄球菌乳腺炎的免疫保護(hù)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 劉源;豬胸膜肺炎放線桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)ΔnarQ/narP突變株構(gòu)建及功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 蔡玉;雷公藤甲素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

10 李善文;蟾蜍靈對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

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本文編號(hào)：2523481