【摘要】： 前言 關(guān)節(jié)軟骨容易發(fā)生損傷和退變,再生能力差,對軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)治療主要集中在細(xì)胞治療上,包括應(yīng)用成熟軟骨細(xì)胞、軟骨祖細(xì)胞及其他細(xì)胞等。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)作為成熟軟骨細(xì)胞的替代品越來越受到重視。ADSCs可以很容易從脂肪組織中獲得,增殖傳代能力強(qiáng),細(xì)胞均一性好,具多向分化潛能,能分化為各種類型組織,包括軟骨和骨。但轉(zhuǎn)移的ADSCs在軟骨缺損部位還沒有產(chǎn)生令人滿意的關(guān)節(jié)軟骨,一個可能的問題是局部沒有足夠能刺激移植細(xì)胞分化的細(xì)胞因子。體外研究報(bào)告顯示,特異的蛋白因子能夠促進(jìn)成人ADSCs向軟骨分化,提高體內(nèi)軟骨修復(fù)能力。相關(guān)的研究表明:TGF-β_1,TGF-β_2,TGF-β_3,FGF,BMP-2,BMP-6,IGF-1等生長因子具有成軟骨能力,因此可以在局部加入這些因子促進(jìn)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化。但外源性細(xì)胞因子易于流失、作用時間短、價格昂貴。故設(shè)想將這些細(xì)胞因子的基因?qū)階DSCs中,通過自分泌相應(yīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化,以此基因修飾的ADSCs作為種子細(xì)胞來構(gòu)建組織工程軟骨,用于軟骨缺損和退變的治療將具有重要意義。 目前,應(yīng)用IGF-1基因轉(zhuǎn)染ADSCs國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用Ⅰ型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合,對存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)和體外擴(kuò)增,對其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將IGF-1轉(zhuǎn)入ADSCs,G418篩選陽性克隆細(xì)胞并結(jié)合低血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化,為軟骨缺損及退變的基因治療奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 新西蘭大白兔,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)活性觀察 (1)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 采用Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法,分離、純化兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 (2)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo) 抗壞血酸、地塞米松及β-甘油磷酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化。堿性磷酸酶及茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞。 (3)生物學(xué)性狀的觀察 用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞的生長情況并拍照。 2、IGF-1基因轉(zhuǎn)染兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 (1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1的擴(kuò)增純化及鑒定。 (2)建立穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-IGF-1-ADSCs細(xì)胞株,RT-PCR及Western blot檢測IGF-1表達(dá)。 (3)相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并1%甲苯胺藍(lán)染色。 (4)MTT法繪制基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖曲線,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。 (5)免疫熒光法檢測Ⅱ型膠原表達(dá)。 (6)透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)成功 (1)Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織分離得到的細(xì)胞大多為圓形單個核細(xì)胞,貼壁生長后,原代及傳代細(xì)胞生長狀態(tài)良好,各代細(xì)胞形態(tài)基本一致,為長梭形。 (2)抗壞血酸、地塞米松及β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)組ADSCs ALP及鈣結(jié)節(jié)表達(dá)陽性。 2、通過基因轉(zhuǎn)染IGF-1,ADSCs成功誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞 (1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1擴(kuò)增、純化成功。 (2)成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-IGF-1-ADSCs細(xì)胞株。 (3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞變圓并聚集呈結(jié)節(jié)樣生長,1%甲苯胺藍(lán)染色陽性。 (4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),流式細(xì)胞S期比例增大,G_1期比例減小,p＜0.05。 (5)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)陽性。 (6)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)提示細(xì)胞合成代謝旺盛,細(xì)胞功能活躍。 結(jié)論 1、通過Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法,在體外分離培養(yǎng)出增殖能力強(qiáng)的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。 2、通過基因轉(zhuǎn)染ADSCs IGF-1成功誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞,能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白。
【圖文】：

..’\:卜J、了丈·之業(yè)(川I飛::，’;l(狡一之l(川(、:萬、竺O{丈《l()()C圖2，，細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁生長的ADSCS2、免疫熒光法測定細(xì)胞BD表型免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果顯小在ADScs中，抗原決定簇cD44、CDI。9彌散分布細(xì)胞膜表面，在熒光顯微鏡下細(xì)胞膜表面被激發(fā)出綠色熒光，結(jié)果如下:

細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁生長的ADSCS2、免疫熒光法測定細(xì)胞BD表型免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果顯小在ADScs中，抗原決定簇cD44、CDI。9彌散分布細(xì)胞膜表面，在熒光顯微鏡下細(xì)胞膜表面被激發(fā)出綠色熒光，結(jié)果如下:
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：2522672