【摘要】：對病原體的易感性取決于機(jī)體的抵抗力,而抵御病原體入侵的第一道防線是天然免疫。天然免疫系統(tǒng)由許多種類識別及效應(yīng)分子組成,通過模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)如Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)、甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)、清道夫受體(scavenger receptor, SR)、肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)、甘露糖受體(mannose receptor, MR)等特異識別病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMP),產(chǎn)物免疫應(yīng)答,構(gòu)成機(jī)體的抗感染的第一道防線；并通過抗原提呈、提供共刺激信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞及趨化因子的分泌,啟動獲得性免疫應(yīng)答同時指導(dǎo)應(yīng)答的性質(zhì)和強(qiáng)度。 清道夫受體A (scavenger receptor A, SRA),也稱為巨噬細(xì)胞清道夫受體(macrophage scavenger receptor, MSR)或CD204,主要表達(dá)在吞噬細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)如巨噬細(xì)胞(macrophage, MΦ)和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)表面,是最早發(fā)現(xiàn)并克隆的能結(jié)合低密度脂蛋白活性的清道夫受體家族成員。大量研究揭示,SRA在動脈粥樣硬化病程發(fā)生、發(fā)展及其宿主防御中發(fā)揮重要作用。另外,研究表明SRA對內(nèi)毒素休克、高氧性肺損傷及阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease, AD)有保護(hù)作用。 APC利用PRR參與天然免疫對病原微生物的識別和免疫應(yīng)答啟動。近期研究揭示了PRR(包括TLR、MR、FcR、DC、SIGN/CD209.SR及CD205等)在干預(yù)DC的功能、維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、宿主免疫調(diào)節(jié)及防御中發(fā)揮著重要作用。前期研究顯示針對SR進(jìn)行抗原化學(xué)修飾能夠顯著提高抗原的免疫原性。最新研究證據(jù)揭示了一些SR包括SRA可影響APC對應(yīng)激相關(guān)蛋白和相關(guān)抗原的攝取�？墒�,SRA在抗原提呈和獲得性免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。 SRA的意義在于介導(dǎo)相關(guān)配體結(jié)合和內(nèi)吞,近期研究發(fā)現(xiàn)SRA在人肝損傷組織中表達(dá)顯著增加,這促使我們?nèi)パ芯縎RA在機(jī)體肝損傷中的具體作用。已報道,髓系來源抑制性細(xì)胞(MDSC)上表達(dá)的SRA參與對T細(xì)胞活化抑制和后續(xù)肝損傷。我們報道CIH疾病動物模型血清中有可溶性SRA的釋放且SRA蛋白可抑制T細(xì)胞的活化。然而,目前尚不清楚具體是何原因?qū)е驴扇苄許RA分子的釋放,肝功能損傷病人體內(nèi)是否存在可溶性SRA表達(dá)還有待進(jìn)一步檢測。 乙型肝炎病毒(hepatifis B virus,HBV)感染后引起一系列肝臟疾病[無癥狀攜帶、急性肝炎、慢性乙型肝炎(chromc hepatitis B,CHB).肝硬化和肝癌等]。我國HBV感染率高達(dá)57.63%,全國至少有6億人感染過HBV,每年因HBV感染相關(guān)肝病死亡的病患高達(dá)30萬人。目前尚未發(fā)現(xiàn)能徹底清除HBV的藥物,因此HBV感染已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國人民健康的公共衛(wèi)生問題。HBV感染后,宿主的免疫應(yīng)答是一把雙刃劍,既能抑制、殺傷及清除病毒,又能引起炎癥反應(yīng)、造成機(jī)體(特別是肝細(xì)胞)的損傷。免疫系統(tǒng)是一個相當(dāng)復(fù)雜的系統(tǒng),可以肯定的是其在HBV慢性感染的病程和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。但在HBV感染的過程中,免疫系統(tǒng)是如何啟動、工作和相互協(xié)調(diào),與HBV間的相互作用及其關(guān)系如何,在疾病的發(fā)展過程的變化情況,目前還沒有完全清楚。 本課題檢測了慢性HBV感染病人中可溶性SRA的表達(dá)情況,因其提取和純化的限制,為了進(jìn)一步研究SRA作為胞外可溶性蛋白的天然免疫功能及其對獲得性免疫的調(diào)節(jié)作用,我們在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)了人SRAECD蛋白,通過蛋白復(fù)性及純化,獲得了具有生物學(xué)活性的重組蛋白。初步探索人SRAECD蛋白對HBV感染T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響及其分子機(jī)制。 第一章慢性HBV感染情況下可溶性SRA的表達(dá) 乙型肝炎病毒感染可引起一系列嚴(yán)重的肝臟疾病,包括急性和慢性肝炎,肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)。有大量研究證實乙型肝炎病毒本身并不導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷,乙型肝炎病毒感染后主要受到宿主免疫系統(tǒng)對病毒抗原的應(yīng)答,從而引起肝細(xì)胞損傷,天然免疫與獲得性免疫(細(xì)胞免疫和體液免疫)均起著重要作用。宿主的免疫反應(yīng)不僅僅起著清除病毒的作用,還會進(jìn)一步的造成肝細(xì)胞的炎癥及損傷,它們之間的相互作用決定著相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。已報道,CIH疾病動物模型血清中有可溶性SRA的釋放且抑制T細(xì)胞的活化。在本次研究中,我們檢測了慢性HBV感染病人的血清中可溶性SRA的表達(dá)量。 本節(jié)實驗涉及到的全血標(biāo)本共112份。其中22份來自于健康成人(healthy control, HC);28份來自于免疫耐受期的HBV攜帶者(immunotolerant carder,IT)；33份來自十非活動性HBsAg攜帶者(inactive Carrier, IC);29份來自于慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B, CHB)。HC對照的入組標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg陰性、ALT/AST正常、無其他嚴(yán)重疾患。IT、CHB和IC的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版。排除標(biāo)準(zhǔn)為：混合感染HIV、HCV或其它肝炎病毒；急性肝炎、肝硬化或肝癌；半年內(nèi)接受過乙肝抗病毒治療。相關(guān)實驗符合赫爾辛基宣言的要求,并得到南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn),所有患者都簽署了知情同意書。血清學(xué)和病毒學(xué)(HBV DNA定量、HBV血清標(biāo)志物和其他病毒標(biāo)志物)的檢測由南方醫(yī)院肝病中心實驗室完成。采用熒光定量PCR進(jìn)行HBV DNA的定量檢測。采用化學(xué)發(fā)光法檢測HBV血清標(biāo)志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩查其他肝炎病毒(HCV、HDV和HEV)標(biāo)志物。應(yīng)用膠體金法篩查HIV-1和HIV-2。ELISA檢測血清中SRA。結(jié)果表明,HBV慢性感染后,IT期患者血清中可溶性SRA的表達(dá)量會升高,當(dāng)HBV特異性應(yīng)答激發(fā)后,SRA表達(dá)進(jìn)一步提高,但當(dāng)病毒得到控制,IC期患者可溶性SRA的表達(dá)量會有所下降,得到一定程度的恢復(fù)。 第二章人SRAECD蛋白的原核表達(dá) 在慢性HBV感染病人的血清中可溶性SRA的表達(dá)量增加,為了進(jìn)一步研究SRA作為胞外可溶性蛋白的天然免疫功能及其對HBV感染的免疫調(diào)節(jié)作用,我們采用分子生物學(xué)技術(shù),應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得人SRA胞外段蛋白。 我們從人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用PCR技術(shù)從PBMC-cDNA中擴(kuò)增出目的基因片段,將其克隆至原核表達(dá)載體pET41a(+)質(zhì)粒中,經(jīng)PCR、限制性酶切和基因鑒定測序確證后,導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3),在卡那霉素抗性的篩選培養(yǎng)基上獲得了表達(dá)目的基因的pET41a-SRAECD重組大腸桿菌,以IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)hSRAECD/His融合蛋白,超聲裂菌后,經(jīng)SDS-PAGE鑒定融合蛋白存在于包涵體中。包涵體形式的hSRAECD/His融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽氧化-還原系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)性,再以Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE、Western blotting分析鑒定,獲得了純化的hSRAECD蛋白。為進(jìn)一步探索SRA的效應(yīng)功能提供了實驗材料。 第三章人SRAECD蛋白對HBV感染T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響 有研究表明,研究發(fā)現(xiàn)SRA在人肝損傷組織中高表達(dá),髓系來源抑制性細(xì)胞上表達(dá)的SRA參與對T細(xì)胞活化的抑制和后續(xù)肝損傷。已報道CIH動物模型血清中有可溶性SRA的釋放且SRA蛋白可抑制T細(xì)胞的活化。我們發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染病人的血清中可溶性SRA的表達(dá)量增加。本部分工作主要是分離和培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞(PBMC),旨在探討人SRAECD蛋白對HBV感染后細(xì)胞免疫的影響。 無菌分離人外周血單個核細(xì)胞,FCM檢測了人SRA胞外段蛋白對HBV抗原肽刺激CTL胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的影響,發(fā)現(xiàn)SRAECD蛋白可減少分泌IFN-γ和TNF-a的HBV特異性CTL細(xì)胞數(shù)目。FCM檢測了SRAECD與HC/CHB患者T細(xì)胞的結(jié)合,結(jié)果證明SRAECD可與HBV感染患者的T細(xì)胞結(jié)合,明顯高于HC組。同時實驗CFSE標(biāo)記PBMC,將ConA或anti-CD3/28mAb、不同濃度GST-SRAECD蛋白及對照GST蛋白加入PBMC中,24小時收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測細(xì)胞因子IL-2的分泌,夾心ELISA檢測IL-2水平,結(jié)果表明,GST-SRAECD可明顯抑制ConA誘導(dǎo)的PBMC分泌IL-2,且呈劑量依賴性。FCM檢測CD3+T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示,與加入GST蛋白的對照組相比,SRAECD蛋白可明顯抑制CD3+T細(xì)胞增殖,且呈劑量依賴性。同時我們研究證明SRAECD可與T細(xì)胞結(jié)合,且與anti-CD3/28mAb刺激的PBMC結(jié)合明顯高于未刺激組。rhIL-2能逆轉(zhuǎn)SRAECD蛋白抑制T細(xì)胞增殖。 綜上,本次研究揭示了HBV感染及慢性乙肝疾病的轉(zhuǎn)歸過程中SRA的表達(dá)變化,豐富了對HBV感染過程中宿主免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識。SRA抑制抗HBV特異性CD8+T細(xì)胞效應(yīng),提出SRAECD可能通過與HBV感染患者的T細(xì)胞結(jié)合抑制T細(xì)胞活化,豐富了之前提出SRA負(fù)向調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答的觀點。繼續(xù)深入研究,可能為對乙肝患者開展基于SRA為靶點的免疫治療研究提供理論依據(jù)和策略。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 左大明;張麗蕓;盧曉;陳政良;;Balb/C小鼠甘露聚糖結(jié)合凝集素-A糖識別域的原核表達(dá)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2009年02期

2 文江華;孫遼;;A類Ⅰ型和Ⅱ型清道夫受體的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2010年10期

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本文編號：2522545