【摘要】： 副粘病毒Tianjin株是仙臺病毒的一個新基因型,仙臺病毒為嚙齒類動物(鼠類)致死性病原體,在鼠群中可引起致死性肺炎,死亡率高。1999年天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)的普通棉耳狨猴群體中爆發(fā)急性呼吸道傳染病,多種抗生素治療無效,多數(shù)于發(fā)病后5～10天內(nèi)死亡,尸體解剖顯示肺組織灶性壞死。然而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期間,飼養(yǎng)在同一實(shí)驗(yàn)中心的各種實(shí)驗(yàn)用鼠無一例發(fā)病,而該毒株卻導(dǎo)致了普通棉耳狨猴群體的嚴(yán)重下呼吸道感染,表明此病毒在致病性和宿主親嗜性上具有某些新的特點(diǎn),即對嚙齒類動物低致病性,而對普通棉耳狨猴高致病性。進(jìn)一步采用雙抗體夾心ELISA法,檢測嚴(yán)重下呼吸道感染兒童支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的病毒抗原,陽性率為1.92%,表明副粘病毒Tianjin株還可能是人類,特別是兒童下呼吸道感染的重要病原體。 近年來,人類新發(fā)傳染性疾病的病毒病原體(Emerging pathogens)幾乎都是來源于動物,這些病毒跨越種屬感染人類,對人類的健康構(gòu)成了巨大威脅,受到全社會的高度關(guān)注。闡明病毒的高致病性和跨種傳播機(jī)制,對于防控這類傳染病的發(fā)生和流行意義重大。在自然條件下,副粘病毒的宿主特異性限制了種間的傳播。宿主特異性受多因素的影響,病毒表面的糖蛋白起識別和吸附細(xì)胞受體的作用,是決定宿主特異性的主要因素。因此,我們對副粘病毒Tianjin株的糖蛋白—HN蛋白進(jìn)行了真核表達(dá),并對該病毒進(jìn)行了反向遺傳學(xué)的初步研究,為進(jìn)一步研究高致病性和跨種屬傳播機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)分兩部分。在第一部分工作中,構(gòu)建了副粘病毒Tianjin株包膜糖蛋白HN及其分段基因HN1、HN2和HN3的真核表達(dá)載體pEGFP-C2-HN、pEGFP-C2-HN1、pEGFP-C2-HN2和pEGFP-C2-HN3,將其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。Western blot檢測蛋白的表達(dá),用原位ELISA法和紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn),檢測各表達(dá)蛋白的抗原性和生物活性。結(jié)果在熒光顯微鏡下,轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pEGFP-C2-HN、pEGFP-C2-HN1、pEGFP-C2-HN2和pEGFP-C2-HN3的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。Western blot方法可檢測到HN、HN1、HN2和HN3蛋白的表達(dá)。原位ELISA法測得重組HN蛋白、HN1蛋白和HN2蛋白有抗原性,而重組HN3蛋白抗原性較弱。紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn),顯示出HN蛋白和HN3蛋白具有吸附紅細(xì)胞的能力,HN1、HN2蛋白未見明顯的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。 在第二部分工作中,用9-11日齡的雞胚將副粘病毒Tianjin株進(jìn)行傳代,提燃ε吣蚰乙褐脅《}琋A,RT-PCR擴(kuò)增出NP和P基因,構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-NP和pcDNA3.1(+)-P。用融合PCR法擴(kuò)增出L基因。將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-NP和pcDNA3.1(+)-P轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。應(yīng)用間接免疫熒光法和Western blot法檢測到NP蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。為進(jìn)一步研究NP蛋白的功能和利用反向遺傳學(xué)技術(shù)重組副粘病毒Tianjin株,研究其跨種傳播和高致病性奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

EGFP一CZ一HN、pEGFP一CZ-HNI、pEGFP一CZ一HN3菌液PCR結(jié)果erDLZ000:1.HNI;2.H卜2二3.llNreeombinantPlasmidPEGFP一CZ一于INEGFP一CZ~11N2andPEGFP一CZ一HNrkerDLZO00;1.llNI;2.HNZ;3.日卜HN、pEGFP一CZ一HNI、pEGFP一C雙酶切分別得到兩條片段，其門“H入l、HNZ、HN3，4.7Kb條帶

pEGFP一CZ一HN、pEGFP一CZ一HNI、pEGFP一CZ一HNZ、
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R373

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本文編號：2522491