【摘要】： 背景和目的 急性腎損傷是一種常見的臨床綜合征,也是危重癥患者常見的并發(fā)癥和重要的死亡原因。缺血性損傷是急性腎損傷的主要發(fā)病機(jī)制,而缺氧是缺血性損傷中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。腎臟的管狀上皮細(xì)胞的高水平氧耗量及腎臟的特殊脈管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)使得腎臟對缺氧非常敏感,而且近曲腎小管上皮細(xì)胞對缺血性損傷尤為敏感。因此,腎小管上皮細(xì)胞的缺氧性損傷最為關(guān)注,是學(xué)術(shù)界研究的焦點(diǎn)。鐵螯合劑二氯化鈷(COCl2)是常用的化學(xué)缺氧的模擬劑,在國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中已獲得廣泛應(yīng)用。建立一個穩(wěn)定的細(xì)胞缺氧模型,為后續(xù)研究工作的開展具有重要的意義。本研究旨在通過比較不同COCl2濃度和不同缺氧時間時細(xì)胞的生長抑制率和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)蛋白表達(dá)量,來確定后續(xù)研究中細(xì)胞的最佳缺氧條件 材料和方法 選取人的近曲腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)性缺氧方法為細(xì)胞缺氧,即在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入COCl2。使用含不同COCl2濃度的培養(yǎng)液(終濃度分別為0、50、100、150、300、600μM)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,并分別缺氧培養(yǎng)不同時間(0、4、6、12、24、48h),爾后應(yīng)用MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞的生長抑制率,同時收集細(xì)胞提取核蛋白進(jìn)行Western免疫印記定量法檢測細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 1)隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中COCl2濃度的增加,細(xì)胞的生長抑制率呈現(xiàn)增加趨勢；隨著缺氧時間的延長,細(xì)胞的生長抑制率也呈現(xiàn)增加趨勢。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞培養(yǎng)液中COCl2濃度在50-300μM與600μM時,細(xì)胞的生長抑制率有顯著性差異(P0.05),而CoCl2濃度在50-300μM時,雖然細(xì)胞的生長抑制率呈遞增趨勢,但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時,還發(fā)現(xiàn)缺氧時間為48h時,細(xì)胞的生長抑制率顯著高于4-24h(P0.05)；而在缺氧時間為4-24h時,雖然細(xì)胞的生長抑制率亦呈遞增趨勢,但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2)在缺氧時間為0-24h之間,隨著時間的延長,HIF-1α蛋白表達(dá)量漸增加,至24h達(dá)到峰值,48h時HIF-1α蛋白表達(dá)量較24h減少；當(dāng)CoCl2濃度為0-150μM時,隨著COCl2濃度的增加,HIF-1α蛋白表達(dá)量漸增加,當(dāng)CoCl2濃度達(dá)到150μM時,HIF-1α蛋白表達(dá)量較CoCl2濃度為300和600μM時亦高。結(jié)論 最佳缺氧處理?xiàng)l件為細(xì)胞培養(yǎng)液中COCl2終濃度為150μM,缺氧時間為24h,此時對HK-2細(xì)胞的活力影響較小,而且細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)量最多。構(gòu)建理想的細(xì)胞缺氧模型為后續(xù)研究工作的開展提供了必要的基礎(chǔ)。 背景和目的 基因沉默是廣泛存在于生物界的古老現(xiàn)象,是生物體抵御病毒或其它外來核酸入侵以及保持自身遺傳穩(wěn)定的保護(hù)性機(jī)制,廣泛存在于真核生物細(xì)胞中。RNA干擾(RNAi)作為一種新的基因沉默的方法,在基因功能的研究上呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。應(yīng)用RNAi特異性地沉默基因來研究該基因的功能的方法已經(jīng)被國內(nèi)外學(xué)者廣泛接受。RNAi具有高度特異性、高效性和安全性的特點(diǎn),它可以在既不破壞基因結(jié)構(gòu)又不引起基因突變的情況下,敲除某基因,以研究其功能。然而,不同的哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率會有所差別,在實(shí)驗(yàn)中需要對每一種細(xì)胞系選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和最佳的轉(zhuǎn)染條件。適量的轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的最佳終濃度對RNAi基因沉默的效率起著重要作用。本研究旨在評估轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siGLO的效率和確定HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α的最佳濃度。 材料和方法 RNAi的試劑主要包括SMARTpool HIF-1αsiRNA、siGLO siRNA陰性對照和DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑,購自美國Dharmacon公司。轉(zhuǎn)染方法按照公司提供的Protocol進(jìn)行操作。應(yīng)用激光共聚焦熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用熒光定量PCR法進(jìn)行定量分析細(xì)胞中HIF-1αmRNA的表達(dá)量。 結(jié)果 1)4μl轉(zhuǎn)染試劑和終濃度100nM siGLO轉(zhuǎn)染指示劑(即轉(zhuǎn)染試劑與siGLO的比例為4μl:0.2nmol)轉(zhuǎn)染細(xì)胞時可以獲得95%-100%的轉(zhuǎn)染效率。 2)HIF-1αsiRNA終濃度分別為25、50和100nM時,HIF-1αsiRNA沉默HIF-1αmRNA的效率分別為24.0±8.6%、43.0±4.2%和70.0±4.2%。 3)沉默HIF-1α的HK-2細(xì)胞經(jīng)過缺氧處理后,其中HIF-1αmRNA的相對量是僅經(jīng)過缺氧處理細(xì)胞中的3.3%,即在缺氧條件下HIF-1αsiRNA沉默HIF-1αmRNA的效率可達(dá)到96.7%。 結(jié)論 對于HK-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑與siRNA以(4μl：0.2nmol)比例混合、siRNA終濃度為100nM時,可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率和沉默效率。而且,基因沉默的效率不僅與合適的轉(zhuǎn)染試劑、優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件等密切相關(guān),同時還與目的基因的豐富程度密切相關(guān)。 背景和目的 缺氧不利于細(xì)胞的生長,但是細(xì)胞可能通過一系列的基因型和代謝的改變來維持生存,甚至增殖。在缺氧條件下機(jī)體或細(xì)胞會產(chǎn)生一系列的缺氧應(yīng)答反應(yīng),而這些缺氧應(yīng)答反應(yīng)主要通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)來調(diào)控。HIF作為氧自穩(wěn)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,能夠調(diào)節(jié)百余種靶基因的表達(dá),從而使得機(jī)體或細(xì)胞對缺氧缺血性損傷產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)HIF家族共有3個成員,包括HIF-1、HIF-2和HIF-3,其中HIF-1廣泛分布于哺乳動物和人體細(xì)胞內(nèi)。在腎臟缺氧缺血損傷中,HIF-1主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞上。HIF-1是由α亞基和β亞基組成的一種異二聚體,其中α亞基是功能性亞基,p亞基是結(jié)構(gòu)性亞基。缺氧缺血會誘導(dǎo)HIF-1表達(dá)的增加,HIF-1能啟動下游基因表達(dá)上調(diào),迄今發(fā)現(xiàn)的HIF-1的靶基因涉及到缺氧后機(jī)體反應(yīng)的很多方面,包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解、血管形成、細(xì)胞命運(yùn)、紅細(xì)胞再生、細(xì)胞外基質(zhì)代謝和纖維化等等。有關(guān)HIF-1對缺氧缺血狀態(tài)下的組織或細(xì)胞的影響的研究頗多,但結(jié)論不盡相同。有研究表明HIF-1可通過一些保護(hù)性基因如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(Glut-1)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和血紅素加氧酶(HO-1)等對缺氧缺血狀態(tài)下的組織或細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用,改善缺氧缺血性損傷后的能量代謝障礙,促進(jìn)細(xì)胞存活和損傷的修復(fù)。也有研究顯示相反的結(jié)果,HIF-1有促凋亡、加重腎臟損傷、促進(jìn)腎臟纖維化的作用。HIF-1對缺氧狀態(tài)下近曲腎小管上皮細(xì)胞生存的影響逐漸引起人們的關(guān)注。本研究旨在通過siRNA沉默HIF-1α基因來研究HIF-1α對缺氧狀態(tài)下近曲腎小管上皮細(xì)胞生存的影響。 材料和方法 HK-2細(xì)胞隨機(jī)分成5組：(1)正常培養(yǎng)組(Normoxia group),細(xì)胞不經(jīng)過RNAi和缺氧處理,在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；(2)缺氧培養(yǎng)組(Hypoxia group),在正常培養(yǎng)后,細(xì)胞在含150μM CoCl2的培養(yǎng)液中孵育24h；(3)轉(zhuǎn)染試劑組(Transfection group),細(xì)胞在RNAi時僅加入轉(zhuǎn)染試劑,未予以siRNA,并經(jīng)過缺氧處理；(4)陰性對照組(Negative group),細(xì)胞在RNAi時應(yīng)用一個無任何靶基因的siRNA陰性對照,并經(jīng)過缺氧處理；(5)HIF-1αsiRNA組(HIF-1αsiRNA group),細(xì)胞經(jīng)過HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α,并經(jīng)過缺氧處理。應(yīng)用MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞的生長抑制率；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Annexin/PI雙染法)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測法和Western免疫印記定量Caspase-3蛋白量等3種方法檢測細(xì)胞的凋亡情況；應(yīng)用乳酸脫氫酶(LDH)檢測法檢測細(xì)胞壞死情況。 結(jié)果 1)缺氧培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染試劑組、陰性對照組和HIF-1αsiRNA組細(xì)胞的生長抑制率分別為6.2±1.7%、8.1±2.0%、4.6±3.5%和22.1±1.2%。HIF-1αsiRNA組細(xì)胞的生長抑制率顯著高于缺氧培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染試劑組、陰性對照組細(xì)胞的生長抑制率(P0.05),而后三組細(xì)胞的生長抑制率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率,依次為0.5±0.1%、2.8±0.8%、2.3±0.5%、3.0±0.1%和3.3±1.0%;TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡指數(shù),依次為2.8±0.6%、6.3±0.6%、5.8±0.6%、6.3±0.6%和7.1±0.4%。正常培養(yǎng)組細(xì)胞的凋亡率和凋亡指數(shù)顯著低于其他四組(P0.05),而其他四組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；正常培養(yǎng)組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著低于其他四組(P0.05),而其他四組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 3)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH濃度依次為516.7±23.6U／L、618.5±26.2U／L、618.8±46.8U／L、629.8±52.2U／L和822.6±62.3U／LHIF-1αsiRNA組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH濃度顯著高于其他四組(P0.05),而正常培養(yǎng)組則顯著低于其他四組(P0.05)。 結(jié)論 缺氧會引起HK-2細(xì)胞的凋亡和壞死；沉默HIF-1α基因能夠明顯地抑制缺氧狀態(tài)下HK-2細(xì)胞的增殖,并加重其壞死,而對凋亡無明顯影響。從反面論證了HIF-1α基因?qū)θ毖鯛顟B(tài)下人近曲腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。 背景和目的 缺氧可以調(diào)控人近曲腎小管上皮細(xì)胞的多種基因和基因家族的表達(dá)。HIF-1α是缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子,它通過誘導(dǎo)下游的保護(hù)性基因的表達(dá)來保護(hù)缺血性腎損傷。迄今發(fā)現(xiàn)HIF-1的靶基因有百余種,其中有一些基因促進(jìn)細(xì)胞的存活和缺氧后的恢復(fù),比如細(xì)胞能量代謝和血管新生等方面。有研究表明,VEGF是HIF-1重要的靶基因,它能夠抑制腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞存活,并且促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成修復(fù)等,具有細(xì)胞保護(hù)作用。Glut是分布在細(xì)胞膜上的一類跨膜糖蛋白,是葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的載體,其中Glut-1分布最為廣泛,是哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的主要載體,能促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散,并促進(jìn)細(xì)胞能量代謝。有研究表明,Glut-1的過表達(dá)有利于組織細(xì)胞對缺血缺氧的耐受性及組織細(xì)胞損傷的修復(fù),并且能夠使細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下維持生存。本研究通過觀察Glut-1和VEGF等基因的表達(dá)情況來探討HIF-1α對缺氧狀態(tài)下近曲腎小管上皮細(xì)胞影響的可能的分子機(jī)制。 材料和方法 HK-2細(xì)胞隨機(jī)分成5組：(1)正常培養(yǎng)組(Normoxia group),細(xì)胞不經(jīng)過RNAi和缺氧處理,在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；(2)缺氧培養(yǎng)組(Hypoxia group),在正常培養(yǎng)后,細(xì)胞在含150μM COCl2的培養(yǎng)液中孵育24h；(3)轉(zhuǎn)染試劑組(Transfection group),細(xì)胞在RNAi時僅加入轉(zhuǎn)染試劑,未予以siRNA,并經(jīng)過缺氧處理；(4)陰性對照組(Negative group),細(xì)胞在RNAi時應(yīng)用一個無任何靶基因的siRNA陰性對照,并經(jīng)過缺氧處理；(5)HIF-1αsiRNA組(HIF-1αsiRNA group),細(xì)胞經(jīng)過HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α,并經(jīng)過缺氧處理。收集各組細(xì)胞,提取蛋白和RNA。應(yīng)用熒光定量PCR法定量檢測細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α、Glut-1、VEGF和β-actin mRNA的表達(dá)量；應(yīng)用Western免疫印記法定量檢測細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α、Glut-1、VEGF和Tubulin蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 1)正常培養(yǎng)組和HIF-1αsiRNA組細(xì)胞的HIF-1α、Glut-1和VEGF mRNA的表達(dá)量顯著低于其他三組(P0.05)。正常培養(yǎng)組細(xì)胞中HIF-2αmRNA的表達(dá)量顯著低于其他四組(P0.05),而其他四組細(xì)胞中HIF-2αmRNA的表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2)正常培養(yǎng)組和HIF-1αsiRNA組細(xì)胞的HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白的表達(dá)量顯著低于其他三組(P0.05)。正常培養(yǎng)組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)量顯著低于其他四組(P0.05),而其他四組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 HK-2細(xì)胞中Glut-1和VEGF的表達(dá)與HIF-1α的表達(dá)呈同步變化關(guān)系。HIF-1α對缺氧狀態(tài)下HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控下游基因Glut-1和VEGF實(shí)現(xiàn)的,但可能還存在其他的機(jī)制,有待進(jìn)一步深入研究。
【圖文】：

細(xì)胞經(jīng)歷的缺氧時間分別為0、4、6、12、24、48h。通過MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中C。C12濃度的增加，細(xì)胞的生長抑制率呈現(xiàn)增加趨勢;隨著缺氧時間的延長，細(xì)胞的生長抑制率也呈現(xiàn)增加趨勢，見圖1一1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)液中CoC12濃度在50一 300林M與600林M時，細(xì)胞的生長抑制率有顯著性差異(尸<0.05)，而CoC12濃度在50一300林M時，雖然細(xì)胞的生長抑制率呈遞增趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸>0.05)。同時，還發(fā)現(xiàn)缺氧時間為48h時，細(xì)胞的生長抑制率顯著高于4一24h

將HIF一 laSIRNA終濃度為onM時的沉默效率定義為0%，則終濃度分別為25、50和 100nM時，，HIF一 laSIRNA的沉默效率分別為24.0士8.6%、43.0士4.2%和70.0士4.2%，見圖2一2。卜ou.叫。勺潤婦bO口to口QJ男毛口〕25D五50TIH 1001、五圖2一2不同終濃度HIF一 1aSIRNA沉默HIF一 1amRNA效率
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 韓建群;余明華;戴e

本文編號：2522105