【摘要】： 胚胎著床是胎生哺乳動(dòng)物及人類生殖的重要環(huán)節(jié),胚胎著床的關(guān)鍵步驟是胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的侵入。滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的“對(duì)話”精確地調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖分化和子宮內(nèi)膜的蛻膜化。蛻膜是子宮內(nèi)膜基質(zhì)受蛻膜化誘導(dǎo)因子的刺激而增殖和再分化形成的一種特殊組織,它對(duì)妊娠的建立和維持至關(guān)重要。在小鼠,胚胎粘附誘導(dǎo)上皮下基質(zhì)細(xì)胞增殖、分化為成熟的蛻膜細(xì)胞,并逐漸向周圍擴(kuò)展,形成的蛻膜細(xì)胞又依照同樣的方向不斷退化和死亡,并被鄰近的滋養(yǎng)層細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬。蛻膜細(xì)胞的增殖和退化同時(shí)并存,二者在動(dòng)態(tài)平衡中協(xié)調(diào)蛻膜細(xì)胞的數(shù)量和滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入�，F(xiàn)已表明,蛻膜細(xì)胞的增殖與退化是一個(gè)涉及多種因素的細(xì)胞凋亡過程。鑒于該過程與腫瘤侵襲過程的相似性,其涉及的調(diào)控機(jī)制也是目前生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。 在諸多參與細(xì)胞凋亡的因子中,腫瘤壞死因子TNF是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類重要的細(xì)胞因子,TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)作為其家族成員是近幾年腫瘤預(yù)防和治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)室在前期的小鼠子宮免疫組化時(shí)發(fā)現(xiàn),TRAIL在植入前的子宮上皮及植入后蛻膜細(xì)胞的表達(dá)呈現(xiàn)出很強(qiáng)的時(shí)空特異性,并且此期間TRAIL特異的凋亡受體MK(Mouse Killer)的表達(dá)也呈相互配合的趨勢,這提示TRAIL信號(hào)可能與小鼠植入后蛻膜細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系,可能參與了妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的進(jìn)程。 基于前期試驗(yàn)結(jié)果,本試驗(yàn)采用基因工程技術(shù)、細(xì)胞原代培養(yǎng)、Western blotting、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR以及宮角注射等方法初步探討TRAIL對(duì)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的作用及其分子機(jī)理。該研究將為闡明胚胎著床的分子機(jī)理補(bǔ)充新的證據(jù),同時(shí)也為胚胎植入與腫瘤侵襲的比較研究提供新的視野。 第一部分TRAIL在小鼠子宮蛻膜細(xì)胞中的表達(dá) 目的:篩選分離提取小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的最佳方法,了解原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生長特性,分析基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)蛻膜化之后TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)情況。 方法:胰酶消化法和混合酶消化法分離提取并培養(yǎng)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞,采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測波形蛋白的表達(dá)對(duì)其純度進(jìn)行鑒定,通過檢測細(xì)胞貼壁率找出基質(zhì)細(xì)胞生長所需的最適pH,采用MTT試驗(yàn)繪制生長曲線,找到其對(duì)數(shù)生長期,最后用孕酮、雌二醇和cAMP誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化,RT-PCR和Western blotting分別檢測不同時(shí)間點(diǎn)TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:1.相對(duì)于混合酶消化法,胰酶消化法成本低,省時(shí)省力,且提取培養(yǎng)的原代妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多,純度較高,達(dá)到(95.8±0.3)%;2.基質(zhì)細(xì)胞生長的最適pH值為7.0,原代培養(yǎng)12-48h為其對(duì)數(shù)生長期,48h后即進(jìn)入平臺(tái)期;3.小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)蛻膜化后,TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)隨時(shí)間增長而顯著升高(p0.05)。 結(jié)論:成功篩選出高效可行、簡單實(shí)用的基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,并初步了解基質(zhì)細(xì)胞的生長特性,同時(shí)對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)后,發(fā)現(xiàn)TRAIL在蛻膜化過程中有特異的表達(dá)變化。 第二部分卵巢激素對(duì)小鼠子宮中TRAIL基因表達(dá)的調(diào)控 目的:探討孕酮、雌二醇是否對(duì)TRAIL基因在小鼠子宮的表達(dá)具有調(diào)控作用。 方法:將去卵巢小鼠隨機(jī)分為4組,每組3只:1.孕酮組,0.2mg/mouse;2.雌二醇組,100ng/mouse;3.孕酮+雌二醇組,劑量同前;4.對(duì)照組,芝麻油0.1ml/mouse。分別于皮下注射后0h、6h、12h、24h取各組小鼠子宮,采用熒光定量PCR對(duì)TRAIL mRNA的水平進(jìn)行檢測,同時(shí)用Western blotting檢測其蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果:孕酮和雌二醇均能顯著提高TRAIL mRNA和蛋白在小鼠子宮中的表達(dá),且表現(xiàn)為時(shí)間依賴性,隨時(shí)間增長TRAIL mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加(p0.05),孕酮和雌二醇聯(lián)合使用時(shí),調(diào)控作用有一定的疊加效應(yīng)(p0.05)。 結(jié)論:TRAIL基因在小鼠子宮中的表達(dá)受到孕酮、雌二醇的正向調(diào)節(jié)。 第三部分TRAIL對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的功能研究 第一節(jié)TRAIL過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 目的:構(gòu)建TRAIL過表達(dá)質(zhì)粒,為研究TRAIL基因的功能提供工具。 方法:通過設(shè)計(jì)兩條分別帶有SalI和MluI酶切位點(diǎn)的PCR引物,將TRAIL的全長cDNA序列作為目的序列克隆入pSEB-HUS載體,即pSEB-HUS-TRAIL。通過菌液PCR檢測、SalI和MluI雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。菌液Western blotting檢測pSEB-HUS-TRAIL在菌液中是否表達(dá)TRAIL蛋白。 結(jié)果:成功構(gòu)建TRAIL基因的過表達(dá)質(zhì)粒pSEB-HUS-TRAIL。 第二節(jié)TRAIL干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 目的:構(gòu)建、篩選針對(duì)TRAIL基因的干擾質(zhì)粒,為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。 方法:設(shè)計(jì)、合成4條靶向TRAIL基因的干擾序列,將干擾序列克隆到SfiI酶切后的pSEB-HUS-TRAIL質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化DH5α后進(jìn)行菌液PCR和質(zhì)粒測序,分別命名為SipSEB-TRAIL1、SipSEB-TRAIL2、SipSEB-TRAIL3、SipSEB-TRAIL4。將4個(gè)干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,選擇72h后GFP熒光最弱的干擾質(zhì)粒用PacI酶切除去TRAIL基因后自連,即為篩選出的TRAIL干擾質(zhì)粒。 結(jié)果:成功構(gòu)建、篩選出SipSEB-TRAIL3為TRAIL基因干擾質(zhì)粒。 第三節(jié)TRAIL對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的影響 目的:觀察過表達(dá)及干擾TRAIL對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及蛻膜化進(jìn)程的影響,以及對(duì)在體蛻膜化進(jìn)程的影響。 方法:TRAIL過表達(dá)或干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠基質(zhì)細(xì)胞后誘導(dǎo)蛻膜化發(fā)生,于轉(zhuǎn)染后72h時(shí),通過RT-PCR及Western blotting評(píng)價(jià)其轉(zhuǎn)染TRAIL過表達(dá)及干擾質(zhì)粒后增強(qiáng)或抑制TRAIL表達(dá)的效應(yīng)。通過MTT法觀察蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的生長和增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡率,Western blotting檢測催乳素蛋白表達(dá)的變化情況。過表達(dá)和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后收集逆轉(zhuǎn)錄病毒并測定滴度。通過宮角注射分別給予妊娠d3.5小鼠TRAIL過表達(dá)和干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒,d7和d8時(shí)取蛻膜組織進(jìn)行稱重,同時(shí)統(tǒng)計(jì)植入點(diǎn)數(shù)目。 結(jié)果:TRAIL過表達(dá)質(zhì)粒能夠上調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá),干擾質(zhì)粒能有效地抑制TRAIL mRNA及蛋白的表達(dá)(p0.05)。在體外,TRAIL過表達(dá)使蛻膜基質(zhì)細(xì)胞被阻滯在G0/G1期、抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖并促使其凋亡,催乳素表達(dá)降低,而干擾TRAIL促進(jìn)蛻膜細(xì)胞的增殖,減少了蛻膜細(xì)胞的凋亡,催乳素表達(dá)升高。體內(nèi)宮角注射逆轉(zhuǎn)錄病毒,過表達(dá)TRAIL使蛻膜組織重量降低,干擾TRAIL使蛻膜組織重量增加,過表達(dá)和干擾TRAIL后小鼠子宮植入位點(diǎn)均顯著減少。 結(jié)論:過表達(dá)TRAIL抑制妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進(jìn)程,干擾TRAIL促進(jìn)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進(jìn)程,但二者均造成植入胚胎數(shù)量的下降,其原因可能是破壞了子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡的平衡。 第四節(jié)TRAIL影響小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的分子機(jī)理 目的:初步探討TRAIL影響妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的分子機(jī)理。 方法:RT-PCR檢測妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)蛻膜化后,TRAIL受體DcR1、DcR2和MK的mRNA表達(dá)�；|(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRAIL過表達(dá)質(zhì)粒后誘導(dǎo)其蛻膜化,Western blotting檢測pro-caspase-8及Bcl-2的蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:DcR1 mRNA在誘導(dǎo)基質(zhì)蛻膜化72h升高顯著(p0.05),DcR2 mRNA隨時(shí)間變化不顯著(p0.05),MK mRNA的表達(dá)隨誘導(dǎo)蛻膜化時(shí)間的增長而顯著升高,且表達(dá)量在24h時(shí)達(dá)到高峰(p0.05)�；|(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRAIL過表達(dá)質(zhì)粒72h后的pro-caspase-8及Bcl-2蛋白水平顯著降低(p0.05)。 結(jié)論:蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中TRAIL過表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞凋亡水平提高,相反,干擾TRAIL表達(dá)使細(xì)胞凋亡水平降低,推測小鼠子宮蛻膜細(xì)胞中TRAIL主要通過與膜受體MK結(jié)合引起pro-caspase-8活化為caspase-8,同時(shí)下調(diào)Bcl-2表達(dá)而通過線粒體依賴途徑誘導(dǎo)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。 綜上所述,本試驗(yàn)證明了TRAIL在小鼠蛻膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中具有特異的表達(dá),且受到孕酮和雌二醇的正調(diào)節(jié),TRAIL具有促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡、抑制子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的功效,推測其主要通過與膜受體MK結(jié)合引起pro-caspase-8活化為caspase-8,同時(shí)下調(diào)Bcl-2表達(dá),通過線粒體依賴途徑誘導(dǎo)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

圖 1-3 基質(zhì)細(xì)胞生長曲線Fig.1-3 The growth curve of stromal cellsX-axis：stromal cell culture time, Y-axis：A570absorbance.鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化誘導(dǎo)及催乳素的表達(dá)培養(yǎng)體系中加入P4、E2和cAMP能誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)的子宮基質(zhì)細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)24h、48h、72h后，原來呈細(xì)長梭形和不規(guī)則星形的貼成較大的雙核或多核細(xì)胞（圖1-4）。

和cAMP能誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)的子宮基質(zhì)細(xì)胞分化為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)24h、48h、72h后，原來呈細(xì)長梭形和不規(guī)則星形的貼壁細(xì)胞逐漸變成較大的雙核或多核細(xì)胞（圖1-4）。圖1-4 基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)蛻膜化Fig.1-4 Decilualization of stromal cells induced with P4,E2plus cAMP treatmentA-C indicated decidual cells at 24-72 h after induction in culture.（Magnification × 200）本試驗(yàn)免疫組織化學(xué)顯示催乳素染色呈陽性(圖1-5)，細(xì)胞大小形狀基本均一，染色特點(diǎn)為胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)小的棕色顆粒，且越近胞核染色越深。蛻膜細(xì)胞標(biāo)志物催乳素的表達(dá)量也隨著蛻膜化誘導(dǎo)時(shí)間的延長而顯著增加（p>0.05）。（圖1-6）。第04期 張晉平：TRAIL在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程中的功能研究 E059-2-25
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R321

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2522205