【摘要】： 目前,抗CD3單克隆抗體已廣泛應(yīng)用于臨床治療器官移植后排斥反應(yīng),療效顯著,但機(jī)體易產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),導(dǎo)致鼠源性抗CD3單克隆抗體被快速清除,半衰期明顯縮短,從而限制了其治療作用。PEG修飾蛋白是蛋白類藥物二次開(kāi)發(fā)中的一項(xiàng)熱點(diǎn)技術(shù),PEG與藥物相連,能有效延長(zhǎng)藥物的半衰期,降低藥物的免疫原性。本文利用PEG修飾鼠源性抗CD3單克隆抗體,擬有效改善其生物學(xué)活性,提高臨床應(yīng)用效果。 本實(shí)驗(yàn)首先以胃蛋白酶酶解鼠抗人CD3單克隆抗體,然后通過(guò)凝膠層析分離及超濾純化得到抗體Fab′,并利用SDS-PAGE檢測(cè)純度。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定胃蛋白酶與抗體的物質(zhì)量之比為2:100,消化24h,反應(yīng)體系pH值為3.0及溫度為37℃的酶解條件,以及巰基乙醇摩爾濃度為0.1mol/L,消化30min的F(ab′)2制備Fab′抗體反應(yīng)條件。結(jié)果得到純度較高的抗體Fab′,并利用薄層掃描純度均達(dá)到95%以上。 接著利用PEG—SPA修飾抗體和抗體片段Fab′,并對(duì)鼠抗人抗CD3單克隆抗體和抗體片段的PEG化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)正交確定了較佳的修飾工藝條件。結(jié)果表明,在pH9.0硼酸緩沖液,反應(yīng)溫度25℃,抗體濃度0.2mg/ml,抗體和PEG摩爾比為1:20,反應(yīng)3小時(shí),所得到的修飾效果最好。 其次通過(guò)PEG化抗體IgG和抗體片段Fab′的體內(nèi)以及體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),考察了修飾后的抗體和抗體片段的免疫活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:修飾后抗CD3單抗全抗,對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖抑制活性下降了32.28%,抗體Fab′下降了7.96%,PEG化Fab′下降了19.92%,其對(duì)T細(xì)胞抑制率有所下降,但細(xì)胞毒性增強(qiáng)不明顯。 最后利用ELISA法測(cè)血液中修飾后的抗體和抗體片段的半衰期。結(jié)果顯示:mPEG修飾后抗體和抗體片段血藥濃度降低明顯減緩,修飾后抗CD3抗體半衰期從2.658347h延長(zhǎng)到8.722217h,延長(zhǎng)了3.28倍。而修飾后抗體Fab′片段半衰期從2.209713h延長(zhǎng)到4.1723h,延長(zhǎng)了1.895倍。 由此我們可發(fā)現(xiàn),利用低分子量的PEG修飾抗體,降低抗體本身的免疫原性,延長(zhǎng)其半衰期這一方法,具有較好的可行性,且可極大的提高單克隆抗體尤其是非人源性抗體在臨床上的應(yīng)用。
【圖文】：

性所致的排斥反應(yīng)一直是限制其臨床應(yīng)用的重要原因【閃。用蛋白酶水解完整抗體得到的Fab片段由于去除了Fc段[65]，因而大大降低了人抗鼠異種蛋白排斥反應(yīng)，減少了過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，提高了療效�？贵w結(jié)構(gòu)和酶解示意圖如圖2一1所示:圖2一1抗體結(jié)構(gòu)示愈圖FigZ一IThede肚neationofan廿bodystructoreFab片段是由重鏈Fd(即vM祀Hl)和完整輕鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合而成的異二聚體，僅含一個(gè)抗原結(jié)合部位。與全抗體相比具有許多優(yōu)勢(shì)【661，例如:(l)不受位于巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨細(xì)胞等細(xì)胞上的Fc受體的影響;(2)不沉淀抗原;(3)比F(ab，)2更易制備和純化;(4)在正常組織中分解放射性標(biāo)記片段比整個(gè)IgG偶聯(lián)物更快;(5)降低免疫原性(Fc區(qū)缺失)，使人抗鼠免疫球蛋白(HAMA)反應(yīng)最小化;(6)更不易遭到吞噬細(xì)胞攻擊;(7)分子量小，到達(dá)腫瘤部位迅速，故已成為最新的研究熱點(diǎn)。2.2材料與方法2.2.1試劑與材料鼠抗人CD3單克隆抗體:北京天廣實(shí)生物技術(shù)有限公司;Se帥adexG一75:瑞典 AmershamBioseiences;甘氨酸(生化試劑):上�？到萆锟萍及l(fā)展有限公司;

pH為4.0，溫度為37，C�？疾旆磻�(yīng)時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物F(ab，)2得率的影響。F(ab’)2得率計(jì)算公式如下:F(ab恤得率=F(ab’)2產(chǎn)t八gG投入t‘100%由圖2一6可知，酶解反應(yīng)24h，抗體已基本酶解完全， sDS識(shí)AGE凝膠電泳圖上，，全抗條帶己基本上沒(méi)有，時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)對(duì)得率影響變化不大，且考慮到反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)影響F(ab，)z的穩(wěn)定性，選定胃蛋白酶酶解反應(yīng)時(shí)間為24h。卜‘嘴)}.//尸—’。}~/////l

本文編號(hào)：2522083