【摘要】： 目的:造血干細(xì)胞移植后免疫重建及急性移植物抗宿主病(acutegraft-versus-host disease,aGVHD)的研究為本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。NKT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一新型的調(diào)節(jié)型細(xì)胞,α-GalCer(α-galactosylceramide,α-半乳糖神經(jīng)酰胺),能特異性識(shí)別并激活NKT細(xì)胞,迅速的大量的分泌IFN-γ及IL-4。本研究在小鼠同種異基因骨髓移植模型中探討移植后受鼠體內(nèi)α-GalCer的應(yīng)用是否有促進(jìn)免疫重建的作用,同時(shí)不加重aGVHD,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步的探討。方法:1.建立同種異基因清髓性骨髓移植模型。C57BL/6小鼠為供鼠,BALB/c小鼠為受鼠。首先摸索出最小的清髓性輻射劑量,之后以此輻射劑量作為骨髓移植前的預(yù)處理,建立兩個(gè)aGVHD嚴(yán)重程度不同的骨髓移植模型。2.利用aGVHD相對(duì)較輕的骨髓移植模型,實(shí)驗(yàn)組骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer,對(duì)照組骨髓移植后立即腹腔注射溶劑DMSO。移植后同一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)兩組小鼠脾臟的單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD~(3+)、CD4~+、CD8~+、B220~+、CD40~+、CD86~+、CD11c~+、CD80~+細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目;供者細(xì)胞嵌合率;胸腺的單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞組份;造血重建。并進(jìn)行體外造血干細(xì)胞集落的培養(yǎng)及體內(nèi)、外T、B細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)。3.利用aGVHD嚴(yán)重程度不同的兩個(gè)骨髓移植模型,實(shí)驗(yàn)組骨髓移植后立即腹腔注射α-GalCer,對(duì)照組骨髓移植后立即腹腔注射溶劑DMSO。在每個(gè)移植模型中觀察兩組小鼠的生存期、aGVHD的臨床表現(xiàn)和病理改變、供者細(xì)胞嵌合率。并進(jìn)行移植后6小時(shí)血清及移植后d27脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的檢測(cè);體內(nèi)、外胸腺、脾臟、外周血、外周淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞及T細(xì)胞的遷移檢測(cè)。結(jié)果:1.≥7.5Gy TBI為清髓劑量。以7.5Gy TBI為預(yù)處理,在輸注相同的骨髓細(xì)胞數(shù)的前提下,輸注脾細(xì)胞數(shù)3×10~7及1×10~7,建立兩個(gè)aGVHD嚴(yán)重程度不同的同種異基因骨髓移植模型。2.在輸注脾細(xì)胞數(shù)1×10~7骨髓移植模型中,骨髓移植后d70,實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3~+、CD4~+、CD8~+、B220~+、CD40~+及CD86~+細(xì)胞的比例均明顯高于對(duì)照組,CD11c~+、CD80~+細(xì)胞的比例兩組間無(wú)區(qū)別:胸腺單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3~+、CD4~+、CD8~+細(xì)胞的比例兩組間無(wú)區(qū)別,且均較正常小鼠明顯偏低。移植后早期d7,實(shí)驗(yàn)組供者細(xì)胞嵌合率高于對(duì)照組。移植后d3,實(shí)驗(yàn)組外周血白細(xì)胞高于對(duì)照組。體外造血干細(xì)胞集落培養(yǎng),α-GalCer組較DMSO組CFU數(shù)目明顯多。體內(nèi)、外T、B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),α-GalCer組較DMSO組T、B細(xì)胞明顯增殖。3.在aGVHD嚴(yán)重程度不同的兩個(gè)骨髓移植模型中,實(shí)驗(yàn)組小鼠較對(duì)照組小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng),aGVHD臨床表現(xiàn)及病理改變減輕。4.在輸注脾細(xì)胞數(shù)1×10~7移植模型中,移植后6小時(shí)血清中IL-4水平實(shí)驗(yàn)組小鼠與腹腔注射α-GalCer的正常小鼠、腹腔注射α-GalCer的單純照射小鼠無(wú)差異,均明顯高于腹腔注射DMSO的單純照射小鼠;血清中IFN-γ水平實(shí)驗(yàn)組小鼠與腹腔注射α-GalCer的單純照射小鼠無(wú)差異,稍高于腹腔注射DMSO的單純照射小鼠,均明顯低于腹腔注射α-GalCer的正常小鼠。移植后d27脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-10水平實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組,而IFN-γ、IL-2水平實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組。5.體內(nèi)、外遷移實(shí)驗(yàn):在α-GalCer的作用下單個(gè)核細(xì)胞、CD3~+、CD4~+、CD8~+細(xì)胞從胸腺、脾臟、外周血中出來(lái),遷移至外周淋巴結(jié)。結(jié)論:1.BALB/c小鼠接受~(60)Coγ射線TBI的致死劑量是≥7.5Gy。在接受7.5Gy TBI的預(yù)處理后,輸注相同的骨髓細(xì)胞數(shù)的前提下,輸注不同的脾細(xì)胞數(shù)建立兩個(gè)aGVHD嚴(yán)重程度不同的骨髓移植模型,隨著輸注脾細(xì)胞數(shù)增加,aGVHD的嚴(yán)重程度隨之增加。2.移植后α-GalCer的應(yīng)用促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的免疫重建,同時(shí)增加第二刺激信號(hào)CD86、CD40的表達(dá)。3.α-GalCer加速的免疫重建與α-GalCer促進(jìn)供者細(xì)胞的早期植入、促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖與分化、促進(jìn)T、B細(xì)胞的增殖作用有關(guān),而與改善胸腺的功能無(wú)關(guān)。4.移植后α-GalCer的應(yīng)用減輕了aGVHD,而且并未以延遲植入為代價(jià),同時(shí)維持植入的持久。減輕aGVHD的機(jī)制之一:α-GalCer使受者的NKT細(xì)胞分泌大量的IL-4,促使供者的T細(xì)胞向Th2分化;減輕aGVHD的機(jī)制之二:α-GalCer促使T淋巴細(xì)胞從胸腺、脾臟、外周血出來(lái),遷移至外周淋巴結(jié),減少進(jìn)入至靶器官的淋巴細(xì)胞數(shù)量,從而減輕淋巴細(xì)胞對(duì)靶器官的損傷。
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圖片說(shuō)明： 的三組小鼠死亡前白細(xì)胞 <0.5xl護(hù)幾，60d死亡率為100%，接受 7GyTBI的5只小鼠全部長(zhǎng)期存活，生存時(shí)間>60d。四組用時(shí)序檢驗(yàn)，隨著照射劑量的增加，生存時(shí)間明顯縮短，見(jiàn)圖1一2。所以7Gy是亞致死劑量，gGy、8.SGy、
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圖片說(shuō)明： 組小鼠均出現(xiàn)活動(dòng)度減低、翹毛、弓背的表現(xiàn)，，sl組小鼠部分出現(xiàn)頭部脫毛、皮膚破潰，但均無(wú)腹瀉癥狀。Sl組小鼠BMT后的aGVHD臨床評(píng)分曲線，見(jiàn)圖1一4。0﨑0一的衛(wèi)日﨏一O;味龔或幕一一翻 7142128354249腸847077DayS卯 5ttr勸SPILantahan圖l一4骨髓移植后Sl組小鼠的aGVHD臨床評(píng)分曲線4骨髓移植后小鼠的aGVHD病理表現(xiàn)Sl組及53組瀕死前小鼠的肝臟均表現(xiàn)為:肝細(xì)胞濁腫樣變性，甚至壞死，匯管上皮細(xì)胞的壞死，匯管區(qū)及肝實(shí)質(zhì)壞死區(qū)周?chē)罅康牧馨图?xì)胞的浸潤(rùn)，內(nèi)皮靜脈炎。53組小鼠的腸道病理表現(xiàn)為散在分布的腸上皮細(xì)胞的凋亡，
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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1 Madi El Haj;Ami Ben Ya'acov;Gadi Lalazar;Yaron Ilan;;Potential role of NKT regulatory cell ligands for the treatment of immune mediated colitis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年44期

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2 郭蓉姣;NKT細(xì)胞活化與C57BL/6J早孕小鼠流產(chǎn)機(jī)制的初步研究[D];暨南大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：2515723