【摘要】： 目的:觀察硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)對內(nèi)皮細胞凋亡的影響,并從抗氧化的角度初步探討其作用的機制。 方法: 1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分別經(jīng)不同濃度(25、50、100、200μmol /L)和不同時間(6、12、24h)硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)預孵育24h后加入100μg/ml氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,oxLDL)處理24h,以空白組和100μg/ml oxLDL處理24h組作為對照,Hoechst 33258熒光染色觀察細胞核形態(tài)的變化;碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測細胞凋亡; 2.實驗分為四組:①對照組:含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基;②NaHS+oxLDL組:50μmol /L NaHS孵育HUVECs 24h后再加入100μg/ml oxLDL孵育24h;③oxLDL處理組:100μg/ml oxLDL孵育HUVECs24h;④NAC+oxLDL組:1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC,抗氧化劑)孵育HUVECs 24h后再加入100μg/ml oxLDL孵育24h。雙氫羅丹明123(Dihydrohodamine 123, DHR123)染色后,鏡下觀察和FCM測定HUVECs的DHR123熒光強度,以明確細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量的變化情況;羅丹明123(Rhodamine 123, Rh123)染色后,鏡下觀察和FCM測定HUVECs的Rh123熒光強度,以了解細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的變化情況;Western Blot檢測細胞Caspase-3和Caspase-9蛋白質(zhì)的表達。 結(jié)果: 1. H2S抗oxLDL誘導的HUVECs凋亡 ①Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比, oxLDL (100μg/ml)處理組HUVECs中出現(xiàn)大量的核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細胞,而NaHS不同濃度(25、50、100、200μmol /L)和不同時間(6、12、24h)預處理的HUVECs中細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的細胞數(shù)明顯減少,大部分細胞染色質(zhì)呈彌漫均勻的低強度熒光。 ②FCM結(jié)果顯示,與正常對照組相比,oxLDL(100μg/ml)處理組細胞凋亡率明顯增加(p 0.01),而不同濃度(25、50、100、200μmol /L)NaHS預處理組較oxLDL(100μg/ml)處理組細胞凋亡率分別降低80%、85%、89%、92%(均p 0.01);不同時間(6、12、24h)NaHS預處理組較oxLDL(100μg/ml)處理組細胞凋亡率分別降低80%、81%、84%(均p 0.01),50、100、200μmol /L NaHS預處理24h抗凋亡作用最明顯。 2.H2S抗oxLDL誘導的HUVECs凋亡的作用機制 ①HUVECs經(jīng)DHR123染色后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與對照組比較,oxLDL處理組HUVECs的DHR123熒光強度明顯增強,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC孵育24h后,再加入oxLDL 100μg/ml繼續(xù)孵育24h的HUVECs DHR123熒光強度較100μg/ml oxLDL處理組明顯減弱;FCM定量分析結(jié)果顯示,與對照組比較,oxLDL處理組HUVECs的DHR123平均熒光強度升高了2.3倍(p 0.05),50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC預處理HUVECs 24h的DHR123平均熒光強度較100μg/ml oxLDL處理組分別降低了63%和67%(均p 0.05)。表明H2S對oxLDL誘導的細胞內(nèi)ROS的生成具有抑制作用。 ②HUVECs經(jīng)Rh123染色后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與對照組比較,oxLDL處理組HUVECs的Rh123熒光強度明顯減弱,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC孵育24h后,再加入oxLDL 100μg/ml繼續(xù)孵育24h的HUVECs Rh123熒光強度較100μg/ml oxLDL處理組明顯增強;FCM定量分析結(jié)果顯示,oxLDL處理組HUVECs的Rh123平均熒光強度較對照組降低56%(p 0.05),50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC預處理HUVECs 24h的Rh123平均熒光強度較100μg/ml oxLDL處理組分別升高104%和126%(均p 0.05)。表明H2S對oxLDL降低HUVECs的△Ψm具有抑制作用。 ③Western Blot結(jié)果顯示,100μg/ml oxLDL孵育HUVECs 24h后,與正常對照組相比,Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達分別增加29%和24%;50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC預處理組與oxLDL處理組相比HUVECs的Caspase-3、Caspase-9蛋白表達分別降低19%、20%或12%、19%(均p 0.05)。oxLDL引起
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圖片說明： 5 μmol /L NaHS 預處理組可見少量濃染致密的細胞核（圖1B），其余濃度的 NaHS 預處理組細胞染色質(zhì)分布均勻，為彌漫均勻的低強度熒光（圖 1C,D,E），說明 NaHS 預處理明顯減少了 oxLDL 誘導的細胞凋亡。ABC DE F圖 1 不同濃度H2S 預處理對oxLDL誘導HUVECs凋亡核形態(tài)的影響15
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圖片說明： 圖 2 不同濃度H2S 預處理對oxLDL誘導HUVECs凋亡率的影響CON：Control 組（0.5±0.9%）；25 μM：25μmol /L NaHS 預處理+100 μg/ml oxLDL 處理組（2.6±0.8%） ；50 μM：50μmol /L NaHS 預處理+100 μg/ml oxLDL 處理組（1.9±0.9%） ；100 μM：100μmol /L NaHS 預處理+100 μg/ml oxLDL 處理組（1.5±1.2%） ；200 μM：200μmol/L NaHS 預處理+100 μg/ml oxLDL 處理組（1.0±0.7%） ；oxLDL：100μg/ml oxLDL 處理組（13.1±1.5%）（n=3， ±s ，*p<0.05，** p<0.01，與 Control 組相比，，## p<0.01，與 oxLDL 組相比）3.1.3 NaHS 預處理不同時間對 oxLDL 誘導 HUVECs 凋亡核形態(tài)的影響正常組的細胞染色質(zhì)分布均勻，為彌漫均勻的低強度熒光（圖 3A）；100 μg/mloxLDL 處理組 HUVECs 中出現(xiàn)大量的核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細胞（圖 3E）；50 μmol /L NaHS 預處理 6h 和 12h 組可見少量細胞凋亡（核呈濃染致密的固縮形態(tài)），50 μmol /L NaHS 預處理 24h 組細胞染色質(zhì)分布均勻，
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Hydrogen sulfide ameliorates vascular calcification induced by vitamin D3 plus nicotine in rats[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年03期

本文編號：2515504