【摘要】： 目的：探討分離、體外培養(yǎng)、鑒定及體外標(biāo)記兔骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,為進一步的實驗研究打下基礎(chǔ)。 方法：選擇健康幼齡新西蘭大耳白兔,于雙側(cè)髂后上嵴及脛骨上端內(nèi)側(cè)部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培養(yǎng)法(直接貼壁法)分離培養(yǎng)MSCs,對第2、3、4、5、6代MSCs應(yīng)用MTT法測定生長曲線,分析MSCs的生長規(guī)律。對MSCs進行形態(tài)學(xué)觀察,通過流式細胞術(shù)對CD34、CD44、CD45、CD105四種MSCs表面抗原進行鑒定,證明所培養(yǎng)的細胞為MSCs。采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine, BrdU)體外標(biāo)記兔MSCs,檢測不同標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度的標(biāo)記陽性率。 結(jié)果：全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)的原代MSCs接種4天后可以被觀察到,形態(tài)均勻成梭形,生長增殖迅速,符合MSCs生長的特性,7-8天MSCs融合接近80%,傳代培養(yǎng)生長良好。MSCs生長曲線呈S型,由生長曲線分析可知,MSCs在培養(yǎng)第4-8天為高速生長期,MSCs在第3-5代生長最為旺盛。經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定,CD34 (-)、CD45 (-)、CD44 (+)、CD105(+),證明所培養(yǎng)的細胞為較純的MSCs。BrdU體外標(biāo)記兔MSCs的陽性率達到85-90%,40μmol/L、標(biāo)記72h為最佳標(biāo)記濃度和標(biāo)記時間。 結(jié)論：應(yīng)用本實驗方法,可以分離、純化培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞且操作簡便,效率高,經(jīng)濟實用。所培養(yǎng)的MSCs體外生長穩(wěn)定、增殖速度快、貼壁率高、可連續(xù)傳代,可用于MSCs功能及應(yīng)用的進一步研究。應(yīng)用BrdU體外標(biāo)記兔MSCs是安全可靠的。 目的：建立兔煙霧吸入性損傷模型。 方法：采用自制煙霧吸入性損傷致傷儀致傷。以干燥的松木屑及煤油為發(fā)煙材料,在密閉環(huán)境使兔自行吸入煙霧10min,間隔2min再次致傷10min。傷后觀察兔臨床表現(xiàn)、各時點血氣及傷后24h肺組織切片觀察。 結(jié)果：(1)傷后兔呼吸頻率明顯加快,呼吸困難明顯,肺部可及干Up音,24h后呼吸癥狀改善。(2)血氣示PaO2由傷前90.20±18.44mmHg分別降至傷后10min 63.48±12.90mmHg、傷后2h 56.96±10.23mmHg及傷后4h 65.76±12.55mmHg,與傷前比較差異有顯著性(P0.05)。至傷后24h基本恢復(fù)正常；PaCO2由傷前32.10±5.48mmHg分別升至傷后10min 41.72±6.33mmHg、傷后2h 43.12±5.42mmHg及傷后4h 39.11±6.91mmHg與傷前比較差異有顯著性(P0.05)。至傷后24h基本恢復(fù)正常。(3)組織病理學(xué)觀察：大體觀見傷肺蒼白,包膜緊張,大片出血灶；光鏡下見血管內(nèi)充血、肺泡水腫和出血、間質(zhì)水腫及炎性細胞浸潤等肺損傷改變。 結(jié)論：本文推薦的兔煙霧吸入性損傷模型是一種簡便、實用、穩(wěn)定、經(jīng)濟、重復(fù)性好的煙霧吸入性損傷模型,適于煙霧吸入性損傷的研究。 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植對煙霧吸入性損傷兔炎癥反應(yīng)的影響,評價MSCs移植的治療效果,初步揭示MSCs移植對煙霧吸入性損傷影響的可能機制。 方法：64健康新西蘭大耳白兔隨機數(shù)字表法分為2組：煙霧吸入性損傷組(S組)和MSCs治療組(M組),每組各32只動物。另取8只動物做正常對照組測基礎(chǔ)值。正常對照組不致傷,僅經(jīng)耳緣靜脈注入10ml PBS液；S組致傷后立即經(jīng)耳緣靜脈注入10ml PBS液；M組致傷后立即經(jīng)耳緣靜脈注入內(nèi)含1×107個第三代兔MSCs的PBS液10ml。S組和M組傷后分為2h、4h、6h、24h觀察,每個時間點8只動物,主要觀察指標(biāo)和方法：①采用ELISA法檢測正常對照值、S組和M組傷后2h、4h、6h外周血以及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)含量并作比較。②采用RT-PCR法檢測S組和M組傷后2h、4h、6h肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA的表達并作比較。③檢測正常對照組、S組和M組傷后6h和24h肺水質(zhì)量分數(shù)并作比較。④大體和光鏡下分別觀察正常對照組、S組和M組傷后2h、4h、6h、24h肺組織和支氣管組織的變化。 結(jié)果：(1)促炎因子：實驗開始后2h、4h、6h,M組外周血和肺組織中主要促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α含量與相應(yīng)S組對應(yīng)時間點值相比均顯著降低(P0.05)。S組外周血和肺組織中主要促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α含量與相應(yīng)組內(nèi)正常對照值相比均顯著升高(P0.05)。M組外周血和肺組織中IL-1β含量與組內(nèi)正常對照值相比無顯著差異(P0.05),M組外周血和肺組織中TNF-α含量與組內(nèi)正常對照值相比顯著升高(P0.05),與組內(nèi)正常對照值相比,肺組織中IL-6含量顯著升高(P0.05)而外周血IL-6含量無顯著差異(P0.05)。(2)抗炎因子：實驗開始后2h、4h、6h,M組外周血主要抗炎因子IL-10含量與相應(yīng)S組對應(yīng)時間點值相比均顯著升高(P0.05),M組和S組2h、4h、6h含量較各自正常對照值均顯著升高(P0.05)；M組肺組織中IL-10含量與相應(yīng)S組對應(yīng)時間點值相比,4h和6h顯著升高(P0.05)而2h升高不顯著(P0.05)。組內(nèi)比較,S組2h、4h、6h IL-10含量較正常對照值差異不顯著(P0.05),M組4h和6h顯著升高(P0.05)而2h升高不顯著(P0.05)。(3)VEGF水平：S組和M組外周血與肺組織中VEGF水平傷后2h、4h、6h迅速升高,與正常對照值比較均顯著升高(P0.05)。M組外周血傷后各時間點VEGF水平與S組對應(yīng)時間點相比,VEGF值卻顯著下降(P0.05)；而M組肺組織傷后各時間點VEGF水平與S組對應(yīng)時間點相比VEGF值卻顯著升高(P0.05)。(4)主要炎癥因子的mRNA表達：TNF-α,IL-1β、IL-6 mRNA相對表達量在M組4h和6h顯著低于S組相應(yīng)時間點TNF-α,IL-1β、IL-6 mRNA相對表達量(P0.05),僅M組2h IL-6 mRNA相對表達量與相應(yīng)時間點比較無顯著差異(P0.05)；M組各時間點IL-10 mRNA相對表達量均顯著高于S組相應(yīng)時間點IL-10 mRNA相對表達量(P0.05)。(5)處置后6h和24h,M組實驗結(jié)束后肺水質(zhì)量分數(shù)較S組均顯著降低(P0.05)。S組和M組6h和24h與正常對照值比較均顯著升高(P0.05)。(6)病理學(xué)觀察：大體觀察：從色澤、包膜緊張度、光滑度、充血狀況、出血壞死灶大小、分泌物等指標(biāo)綜合觀察,M組各時間點較S組改善明顯,正常對照組和U組未見異常。組織病理學(xué)觀察：從上皮脫落、充血、出血、滲出、肺泡隔情況、肺水腫、肺不張、肺氣腫、炎癥細胞浸潤、成纖維細胞增生等指標(biāo)綜合觀察,M組各時間點支氣管和肺組織較S組改善明顯,正常對照組結(jié)構(gòu)正常。 結(jié)論：MSCs靜脈移植至煙霧吸入性損傷兔體內(nèi),能顯著降低其全身和局部主要促炎因子水平,升高其全身和局部抗炎因子水平,減少其血管外肺水,改善肺和氣管組織損傷程度,對煙霧吸入性損傷具有抗炎保護作用�？寡�-免疫調(diào)節(jié)作用是MSCs移植對煙霧吸入性損傷治療作用的另一主要機制。 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植對煙霧吸入性損傷兔組織修復(fù)的影響。 方法：32健康新西蘭大耳白兔隨機數(shù)字表法分為4組：正常對照組(C組)、正常對照+MSCs治療組(U組)、煙霧吸入性損傷組(S組)和MSCs治療組(M組),每組8只實驗動物。C組不致傷,僅經(jīng)耳緣靜脈注入10ml PBS液；U組也不致傷,僅經(jīng)耳緣靜脈注入內(nèi)含1×107個BrdU標(biāo)記的第三代兔MSCs的PBS液10ml；S組致傷后立即經(jīng)耳緣靜脈注入10ml PBS液；M組致傷后立即經(jīng)耳緣靜脈注入內(nèi)含1×107個BrdU標(biāo)記的第三代兔MSCs的PBS液10ml。4組分為7d和28d兩個時間點觀察,每個觀察點4只動物,主要觀察指標(biāo)和方法：①大體和光鏡下分別觀察4組傷后7d和28d肺組織和支氣管組織的變化。②采用免疫組化技術(shù)觀察4組處置后7dMSCs體內(nèi)“歸巢”情況；采用免疫組化雙染色技術(shù)觀察4組處置后28dMSCs體內(nèi)分化情況。 結(jié)果：①大體觀察：從色澤、包膜緊張度、光滑度、充血狀況、出血壞死灶大小、分泌物等指標(biāo)綜合觀察,M組7d和28d較S組改善明顯,C組和U組未見異常。組織病理學(xué)觀察：從上皮脫落、充血、出血、滲出、肺泡隔情況、肺水腫、肺不張、肺氣腫、炎癥細胞浸潤、成纖維細胞增生等指標(biāo)綜合觀察,M組7d和28d支氣管和肺組織較S組改善明顯,C組和U組結(jié)構(gòu)正常。②免疫組織化學(xué)染色顯示M組BrdU標(biāo)記的MSCs傷后7天能在支氣管組織和肺組織中大量“歸巢”,而C組、S組及U組未見或者極少見“歸巢”。③免疫組化雙染色顯示M組可見水通道蛋白-5(AQP-5)和BrdU雙染陽性細胞,說明MSCs在肺內(nèi)能分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞；可見堿性磷酸酶(AKP)和BrdU雙染陽性細胞,說明MSCs在肺內(nèi)能分化為肺泡Ⅱ型上皮細胞；可見CD34和BrdU雙染陽性細胞,說明MSCs在肺內(nèi)能分化為肺血管內(nèi)皮細胞。C組、U組、S組均未見上述雙染色陽性細胞。 結(jié)論：經(jīng)靜脈移植至煙霧吸入性損傷兔體內(nèi)的MSCs均能“歸巢”至損傷和炎癥反應(yīng)明顯的肺組織和支氣管組織區(qū)域并分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞以及肺血管內(nèi)皮細胞,減輕肺組織損傷,可能參與并加快了煙霧吸入性損傷的組織修復(fù)過程。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 葉發(fā)剛;夏長所;張衛(wèi)兵;夏仁云;;兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2006年04期

2 楊天德,楊宗城,羅奇志;煙霧吸入傷大鼠肺組織白介素-6和α-干擾素的變化及意義[J];重慶醫(yī)學(xué);2004年11期

3 徐青鐳,吳海山,周維江;兔骨髓間充質(zhì)干細胞的提取與體外培養(yǎng)[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年03期

4 朱峰;胡貞貞;郭光華;;肺外成體干細胞移植治療急性肺損傷研究進展[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年06期

5 安靜,黎鰲,楊宗誠,尤忠義,魏鉅菊;家兔煙霧吸入傷模型的制作[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1987年01期

6 郝嘉,李永旺,肖穎彬;大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞體外培養(yǎng)和鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年05期

7 徐順貴;吳國明;徐智;馮起甲;王關(guān)嵩;張健鵬;;組織塊法培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的綜合鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2007年01期

8 淦鑫;郭光華;王年云;;煙霧吸入性損傷修復(fù)模型IL-1β和PGE2的動態(tài)變化分析[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年15期

9 馮善偉,姚曉黎,李中,柳太云,黃文,張成;BrdU體外標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年02期

10 周莉;肺泡Ⅱ型上皮細胞及其分離鑒定與原代培養(yǎng)[J];中國肺癌雜志;2003年03期

，

本文編號：2514577