【摘要】： 細(xì)胞分裂過程中,染色體的正確分離得以將遺傳物質(zhì)精確地、均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。不正確的染色體分離會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生及先天性基因缺陷性疾病,如Down Syndrome就是由于多余的21號染色體拷貝。染色體分離這一復(fù)雜生物學(xué)進(jìn)程是如何被精確而有序的調(diào)控的,其調(diào)控的具體分子機(jī)理一直以來都是生物醫(yī)學(xué)研究者們的熱衷問題。最近的研究顯示,Mde4(SPBC6B1.04)、Swi5(SPBC409.03)及Sfr1(SPBC28F2.07)蛋白在染色體分離過程中發(fā)揮重要作用,但其蛋白復(fù)合物構(gòu)成及調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不清。在本實(shí)驗(yàn)中,我們開發(fā)了一種新的基于大片段同源基因重組的蛋白標(biāo)記技術(shù),即在Mde4、Swi5、Sfr1靶基因終止密碼子上、下游臨近區(qū)域設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出長度大約219-500bp左右的片段,并在片段兩端引入酶切位點(diǎn),從而將它克隆入我們所構(gòu)建的含抗G418基因及TAP標(biāo)記基因的pTAPKan1質(zhì)粒載體中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母后,克隆PCR證實(shí)了我們的標(biāo)記方法具有重組效率高及特異性好的特點(diǎn)。進(jìn)一步的Western blot證實(shí),所標(biāo)記的TAP蛋白呈正常表達(dá),經(jīng)過兩步串聯(lián)親和純化后,蛋白銀染色結(jié)果證實(shí)所純化的蛋白樣品以高純度蛋白復(fù)合物形式存在。結(jié)合最新的質(zhì)譜分析技術(shù),我們在正常生理水平上對上述三種蛋白復(fù)合物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,研究不僅證實(shí)了已知的Swi5-Swi2及Swi5-Sfr1蛋白復(fù)合物的存在,而且發(fā)現(xiàn)了新的Mde4及Swi5作用蛋白,分別為Dnt1及Sir2蛋白,盡管其確切功能尚有待于發(fā)現(xiàn),但有理由相信,這兩種蛋白在染色體分離的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)證實(shí)在Swi5及Sfr1蛋白均存在著磷酸化位點(diǎn)。Swi5在第72號絲氨酸被磷酸化,而Sfr1包含有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)(絲氨酸26, 109和165)。
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圖片說明： 在有絲分裂過程中,微管周圍的中心粒結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化.減數(shù)分裂開始時(shí),染色體開始重新排列,核結(jié)構(gòu)的變化是由紡綞體結(jié)構(gòu)中的微管所介導(dǎo)完成的,在減數(shù)分裂I期的分裂前期,這種核結(jié)構(gòu)的變化被形象的稱為馬尾運(yùn)動(dòng)（圖2.1）。圖 2.1 減數(shù)分裂時(shí)細(xì)胞核的馬尾運(yùn)動(dòng)，圖上的數(shù)字分別代表不同時(shí)間點(diǎn)（min）端粒的聚集和核的馬尾運(yùn)動(dòng)對于有效的同源配對和減數(shù)分裂時(shí)的同組來說是至關(guān)重要的，端粒結(jié)合蛋白 Taz1 和紡綞體結(jié)構(gòu)構(gòu)成蛋白 Kms1 在減數(shù)分裂期時(shí)端粒的聚集和馬尾運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮重要功能[100-104]，，dhc1 基因編碼微管肌動(dòng)蛋白的重鏈，敲除此基因?qū)е埋R尾運(yùn)動(dòng)缺失，進(jìn)而減少同源配對，而上述三種基因的突變會(huì)導(dǎo)致同源重組率降低 2－10 倍。有效的染色體配對和同源染色體重組需要適度的端粒聚集和馬尾運(yùn)動(dòng)。這些過程有助于同源染色體的平行排列。在大多數(shù)真核細(xì)胞里，同源染色體的配對需要聯(lián)會(huì)復(fù)合物（SC）的參與，SC 形成時(shí)
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圖片說明： 27圖 3.2 Mde4、Swi5、Sfr１的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果lane1：in gene of Mde4, lane2：in gene of Swi5, lane3: Marker,lane4：in gene of Sfr１, lane5：out gene of Mde4, lane6：out gene of Swlane7：out gene of Sfr1.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2513454