【摘要】： 細胞分裂過程中,染色體的正確分離得以將遺傳物質(zhì)精確地、均等地分配給兩個子細胞。不正確的染色體分離會導致癌癥的發(fā)生及先天性基因缺陷性疾病,如Down Syndrome就是由于多余的21號染色體拷貝。染色體分離這一復雜生物學進程是如何被精確而有序的調(diào)控的,其調(diào)控的具體分子機理一直以來都是生物醫(yī)學研究者們的熱衷問題。最近的研究顯示,Mde4(SPBC6B1.04)、Swi5(SPBC409.03)及Sfr1(SPBC28F2.07)蛋白在染色體分離過程中發(fā)揮重要作用,但其蛋白復合物構(gòu)成及調(diào)節(jié)機制仍然不清。在本實驗中,我們開發(fā)了一種新的基于大片段同源基因重組的蛋白標記技術(shù),即在Mde4、Swi5、Sfr1靶基因終止密碼子上、下游臨近區(qū)域設(shè)計引物,擴增出長度大約219-500bp左右的片段,并在片段兩端引入酶切位點,從而將它克隆入我們所構(gòu)建的含抗G418基因及TAP標記基因的pTAPKan1質(zhì)粒載體中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母后,克隆PCR證實了我們的標記方法具有重組效率高及特異性好的特點。進一步的Western blot證實,所標記的TAP蛋白呈正常表達,經(jīng)過兩步串聯(lián)親和純化后,蛋白銀染色結(jié)果證實所純化的蛋白樣品以高純度蛋白復合物形式存在。結(jié)合最新的質(zhì)譜分析技術(shù),我們在正常生理水平上對上述三種蛋白復合物進行蛋白質(zhì)組學分析,研究不僅證實了已知的Swi5-Swi2及Swi5-Sfr1蛋白復合物的存在,而且發(fā)現(xiàn)了新的Mde4及Swi5作用蛋白,分別為Dnt1及Sir2蛋白,盡管其確切功能尚有待于發(fā)現(xiàn),但有理由相信,這兩種蛋白在染色體分離的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。進一步的磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)證實在Swi5及Sfr1蛋白均存在著磷酸化位點。Swi5在第72號絲氨酸被磷酸化,而Sfr1包含有3個磷酸化位點(絲氨酸26, 109和165)。
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圖片說明： 在有絲分裂過程中,微管周圍的中心粒結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化.減數(shù)分裂開始時,染色體開始重新排列,核結(jié)構(gòu)的變化是由紡綞體結(jié)構(gòu)中的微管所介導完成的,在減數(shù)分裂I期的分裂前期,這種核結(jié)構(gòu)的變化被形象的稱為馬尾運動（圖2.1）。圖 2.1 減數(shù)分裂時細胞核的馬尾運動，圖上的數(shù)字分別代表不同時間點（min）端粒的聚集和核的馬尾運動對于有效的同源配對和減數(shù)分裂時的同組來說是至關(guān)重要的，端粒結(jié)合蛋白 Taz1 和紡綞體結(jié)構(gòu)構(gòu)成蛋白 Kms1 在減數(shù)分裂期時端粒的聚集和馬尾運動過程中發(fā)揮重要功能[100-104]，，dhc1 基因編碼微管肌動蛋白的重鏈，敲除此基因?qū)е埋R尾運動缺失，進而減少同源配對，而上述三種基因的突變會導致同源重組率降低 2－10 倍。有效的染色體配對和同源染色體重組需要適度的端粒聚集和馬尾運動。這些過程有助于同源染色體的平行排列。在大多數(shù)真核細胞里，同源染色體的配對需要聯(lián)會復合物（SC）的參與，SC 形成時
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圖片說明： 27圖 3.2 Mde4、Swi5、Sfr１的 PCR 擴增結(jié)果lane1：in gene of Mde4, lane2：in gene of Swi5, lane3: Marker,lane4：in gene of Sfr１, lane5：out gene of Mde4, lane6：out gene of Swlane7：out gene of Sfr1.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346

【共引文獻】

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本文編號：2513454