【摘要】： 背景和目的 CD20陽性的B細(xì)胞淋巴瘤是臨床上惡性淋巴瘤的最常見類型,目前免疫治療在淋巴瘤的治療中占有顯著的地位。利妥昔單抗(Rituximab,美羅華)在臨床上的應(yīng)用顯著地改善了CD20~+的B細(xì)胞淋巴瘤患者的預(yù)后。但美羅華單抗在體內(nèi)產(chǎn)生的是被動免疫,而在抗腫瘤免疫中,主要還是以主動性的細(xì)胞免疫為主。刺激患者機體產(chǎn)生針對淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng),或同時刺激產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)是淋巴瘤免疫治療的重要研究方向之一。 繼手術(shù)、放療和化療之后,生物治療已成為腫瘤治療的重要手段之一。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是目前體內(nèi)免疫系統(tǒng)中功能最強的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell, APC),以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗已成為當(dāng)前腫瘤免疫治療的一個重要策略。在誘發(fā)腫瘤特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)方面,樹突狀細(xì)胞(DC)起著關(guān)鍵性的作用,而以腺病毒為載體將目的抗原轉(zhuǎn)送至DC中可大大提高DC的抗原提呈及誘導(dǎo)機體產(chǎn)生對該抗原特異性免疫反應(yīng)的效率。 本研究探討編碼小鼠CD20的腺病毒載體Ad5/35修飾的DC誘導(dǎo)小鼠CD20+淋巴瘤的腫瘤特異性免疫,評價其對CD20+淋巴瘤細(xì)胞的免疫保護(hù)作用,為臨床免疫治療CD20+淋巴瘤提供一條新的思路和實驗依據(jù)。 方法 1.建立穩(wěn)定表達(dá)鼠CD20的腫瘤細(xì)胞株:將pcDNA3.1 mCD20/EGFP質(zhì)粒用脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染至B16.F10小鼠腫瘤細(xì)胞中,經(jīng)G418篩選,以EGFP(增強型免疫熒光蛋白)作為報告基因,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,最終獲得B16.F10 mCD20/EGFP細(xì)胞株。 2.細(xì)胞毒實驗:實驗分2組,每組3只小鼠:實驗組(Ad5/35 mCD20感染DCs組);對照組(空載腺病毒dl 70-3感染DCs組)。正常小鼠DC培養(yǎng)的第7天,將Ad5/35 mCD20及dl 70-3以100 pfu/DC的濃度與DC共同孵育4小時,收集DCs,計數(shù),調(diào)整DCs數(shù)為5×10~5/200 ul。按每只小鼠5×105/200μl DCs皮內(nèi)注射至小鼠左后腿上部背側(cè)免疫小鼠,一周后殺小鼠取脾臟進(jìn)行CTL細(xì)胞毒殺傷實驗。以B16.F10mCD20/EGFP細(xì)胞作為靶細(xì)胞,免疫后小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,用3個效靶比(E:T)100:1、50:1和25:1,用乳酸脫氫酶釋放實驗檢測CTL殺傷率。 3.體內(nèi)荷瘤實驗:取C57BL/6小鼠20只,4-6周(18±2)g,雌性,隨機分為兩組,實驗組(Ad5/35 mCD20感染DCs免疫1次,10只),對照組(dl 70-3感染DCs免疫1次,10只)。具體免疫方法同細(xì)胞毒實驗。免疫1周后,以生理鹽水調(diào)整B16.F10 mCD20/EGFP細(xì)胞濃度為2×10~5個/200μl,按每只小鼠2×10~5 B16.F10 mCD20/EGFP細(xì)胞小鼠右后腿上部背側(cè)皮下接種。接種后前14天隔日觀察,14天后每日觀察小鼠成瘤情況,此時尚未成瘤的小鼠繼續(xù)觀察至兩個月。 結(jié)果 1.用G418篩選及流式細(xì)胞儀分選技術(shù)相結(jié)合的方法可獲得穩(wěn)定表達(dá)mCD20的B16.F10 mCD20/EGFP腫瘤細(xì)胞株,流式細(xì)胞儀檢測99.1%的細(xì)胞表達(dá)EGFP,99.7%表達(dá)mCD20。 2.體外細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷實驗:在效靶比為100:1、50:1和25:1情況下,實驗組的殺傷率分別為63.83±7.72%,(t=15.33, P0.01)、47.70±5.31%(t=14.23,P0.01)和22.73±3.11%(t=8.74, P0.01),對照組的殺傷率分別為15.37±0.80%、12.83±2.84%和11.10±1.01%。實驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.荷瘤實驗:對照組小鼠在接種2×10~5細(xì)胞的B16.F10 mCD20/EGFP細(xì)胞后16至18d內(nèi)全部有腫瘤生長,實驗組僅于18d(1只)、20d(2只)、24d(1只)共有4只小鼠成瘤,且腫瘤體積小于對照組。實驗組其余小鼠繼續(xù)觀察至2個月,仍未見腫瘤生長。對照組成瘤率為100%,實驗組為40%,兩組間成瘤率有顯著性差異(x~2=8.57, P0.01)。提示Ad5/35 mCD20能產(chǎn)生抗小鼠淋巴瘤的特異性免疫,對CD20~+的淋巴瘤小鼠有免疫保護(hù)作用。 結(jié)論 Ad5/35 mCD20免疫小鼠能誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生,其CTL殺傷率與效靶比有關(guān);Ad5/35 mCD20能產(chǎn)生抗小鼠淋巴瘤的特異性免疫,對CD20+的淋巴瘤小鼠有免疫保護(hù)作用。
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圖片說明： 調(diào)細(xì)胞濃度約2×106細(xì)胞／ml，取50μl細(xì)胞懸液到離心管中，加入兔抗鼠CD20單克隆抗體混勻進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)(工作濃度1:100)，同時做同型對照，4℃孵育30min，再用PBS洗滌3次，加藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的羊抗兔二抗(工作濃度1:100)，避光孵育30分鐘后，用PBS洗1-2次后重懸，上機檢測。(五)電泳鑒定提取 B16.F10 mCD20/EGFP 細(xì)胞中的總 DNA，并以 5’-gga att cat gag tgg acc ttt ccca-3’為上游引物，，以 5’-cgg gat cct taa gga gcg atc tca tt-3’為下游引物，PCR 擴增后用凝膠電泳檢測 mCD20 是否已整合到 B16.F10 細(xì)胞 DNA 中去。結(jié) 果1. G418 抗性選擇約 12-14 天后對照組細(xì)胞全部死亡。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞則在 G418 抗性選擇 3 周后得到穩(wěn)定增殖的細(xì)胞克隆(圖 1)。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 2. 經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后擴增的細(xì)胞再次用流式細(xì)胞儀檢測報告基因 EGF.F10 mCD20/EGFP 細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖所示， 99.1%的細(xì)胞表達(dá) E，左圖為 B16.F10 細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示背景熒光為 0.81%，右圖為 B1D20/EGFP 細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示 EGFP 表達(dá)為 99.1%(圖 2)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2513808