【摘要】： 背景和目的 CD20陽性的B細胞淋巴瘤是臨床上惡性淋巴瘤的最常見類型,目前免疫治療在淋巴瘤的治療中占有顯著的地位。利妥昔單抗(Rituximab,美羅華)在臨床上的應用顯著地改善了CD20~+的B細胞淋巴瘤患者的預后。但美羅華單抗在體內(nèi)產(chǎn)生的是被動免疫,而在抗腫瘤免疫中,主要還是以主動性的細胞免疫為主。刺激患者機體產(chǎn)生針對淋巴瘤細胞的細胞免疫反應,或同時刺激產(chǎn)生細胞和體液免疫反應是淋巴瘤免疫治療的重要研究方向之一。 繼手術、放療和化療之后,生物治療已成為腫瘤治療的重要手段之一。樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)是目前體內(nèi)免疫系統(tǒng)中功能最強的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell, APC),以DC為基礎的腫瘤疫苗已成為當前腫瘤免疫治療的一個重要策略。在誘發(fā)腫瘤特異性細胞免疫反應方面,樹突狀細胞(DC)起著關鍵性的作用,而以腺病毒為載體將目的抗原轉(zhuǎn)送至DC中可大大提高DC的抗原提呈及誘導機體產(chǎn)生對該抗原特異性免疫反應的效率。 本研究探討編碼小鼠CD20的腺病毒載體Ad5/35修飾的DC誘導小鼠CD20+淋巴瘤的腫瘤特異性免疫,評價其對CD20+淋巴瘤細胞的免疫保護作用,為臨床免疫治療CD20+淋巴瘤提供一條新的思路和實驗依據(jù)。 方法 1.建立穩(wěn)定表達鼠CD20的腫瘤細胞株:將pcDNA3.1 mCD20/EGFP質(zhì)粒用脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染至B16.F10小鼠腫瘤細胞中,經(jīng)G418篩選,以EGFP(增強型免疫熒光蛋白)作為報告基因,用流式細胞儀進行分選,最終獲得B16.F10 mCD20/EGFP細胞株。 2.細胞毒實驗:實驗分2組,每組3只小鼠:實驗組(Ad5/35 mCD20感染DCs組);對照組(空載腺病毒dl 70-3感染DCs組)。正常小鼠DC培養(yǎng)的第7天,將Ad5/35 mCD20及dl 70-3以100 pfu/DC的濃度與DC共同孵育4小時,收集DCs,計數(shù),調(diào)整DCs數(shù)為5×10~5/200 ul。按每只小鼠5×105/200μl DCs皮內(nèi)注射至小鼠左后腿上部背側(cè)免疫小鼠,一周后殺小鼠取脾臟進行CTL細胞毒殺傷實驗。以B16.F10mCD20/EGFP細胞作為靶細胞,免疫后小鼠脾細胞作為效應細胞,用3個效靶比(E:T)100:1、50:1和25:1,用乳酸脫氫酶釋放實驗檢測CTL殺傷率。 3.體內(nèi)荷瘤實驗:取C57BL/6小鼠20只,4-6周(18±2)g,雌性,隨機分為兩組,實驗組(Ad5/35 mCD20感染DCs免疫1次,10只),對照組(dl 70-3感染DCs免疫1次,10只)。具體免疫方法同細胞毒實驗。免疫1周后,以生理鹽水調(diào)整B16.F10 mCD20/EGFP細胞濃度為2×10~5個/200μl,按每只小鼠2×10~5 B16.F10 mCD20/EGFP細胞小鼠右后腿上部背側(cè)皮下接種。接種后前14天隔日觀察,14天后每日觀察小鼠成瘤情況,此時尚未成瘤的小鼠繼續(xù)觀察至兩個月。 結果 1.用G418篩選及流式細胞儀分選技術相結合的方法可獲得穩(wěn)定表達mCD20的B16.F10 mCD20/EGFP腫瘤細胞株,流式細胞儀檢測99.1%的細胞表達EGFP,99.7%表達mCD20。 2.體外細胞毒性T淋巴細胞殺傷實驗:在效靶比為100:1、50:1和25:1情況下,實驗組的殺傷率分別為63.83±7.72%,(t=15.33, P0.01)、47.70±5.31%(t=14.23,P0.01)和22.73±3.11%(t=8.74, P0.01),對照組的殺傷率分別為15.37±0.80%、12.83±2.84%和11.10±1.01%。實驗結果有統(tǒng)計學意義。 3.荷瘤實驗:對照組小鼠在接種2×10~5細胞的B16.F10 mCD20/EGFP細胞后16至18d內(nèi)全部有腫瘤生長,實驗組僅于18d(1只)、20d(2只)、24d(1只)共有4只小鼠成瘤,且腫瘤體積小于對照組。實驗組其余小鼠繼續(xù)觀察至2個月,仍未見腫瘤生長。對照組成瘤率為100%,實驗組為40%,兩組間成瘤率有顯著性差異(x~2=8.57, P0.01)。提示Ad5/35 mCD20能產(chǎn)生抗小鼠淋巴瘤的特異性免疫,對CD20~+的淋巴瘤小鼠有免疫保護作用。 結論 Ad5/35 mCD20免疫小鼠能誘導特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的產(chǎn)生,其CTL殺傷率與效靶比有關;Ad5/35 mCD20能產(chǎn)生抗小鼠淋巴瘤的特異性免疫,對CD20+的淋巴瘤小鼠有免疫保護作用。
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圖片說明： 調(diào)細胞濃度約2×106細胞／ml，取50μl細胞懸液到離心管中，加入兔抗鼠CD20單克隆抗體混勻進行免疫標記反應(工作濃度1:100)，同時做同型對照，4℃孵育30min，再用PBS洗滌3次，加藻紅蛋白(PE)標記的羊抗兔二抗(工作濃度1:100)，避光孵育30分鐘后，用PBS洗1-2次后重懸，上機檢測。(五)電泳鑒定提取 B16.F10 mCD20/EGFP 細胞中的總 DNA，并以 5’-gga att cat gag tgg acc ttt ccca-3’為上游引物，，以 5’-cgg gat cct taa gga gcg atc tca tt-3’為下游引物，PCR 擴增后用凝膠電泳檢測 mCD20 是否已整合到 B16.F10 細胞 DNA 中去。結 果1. G418 抗性選擇約 12-14 天后對照組細胞全部死亡。轉(zhuǎn)染組細胞則在 G418 抗性選擇 3 周后得到穩(wěn)定增殖的細胞克隆(圖 1)。
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圖片說明： 2. 經(jīng)流式細胞儀分選后擴增的細胞再次用流式細胞儀檢測報告基因 EGF.F10 mCD20/EGFP 細胞中的表達水平，結果如圖所示， 99.1%的細胞表達 E，左圖為 B16.F10 細胞經(jīng)流式細胞儀檢測顯示背景熒光為 0.81%，右圖為 B1D20/EGFP 細胞經(jīng)流式細胞儀檢測顯示 EGFP 表達為 99.1%(圖 2)。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：2513808