【摘要】： 藍(lán)藻抗病毒蛋白N (cyanovirin-N, CVN)是一種備受關(guān)注的HIV特異性microbicide候選物,作為一種異源多肽,存在半衰期短、易引起免疫應(yīng)答等缺點(diǎn)；PEG修飾是解決蛋白質(zhì)類藥物在藥用過(guò)程中存在的穩(wěn)定性差,半衰期短等問(wèn)題的有效途徑,但CVN蛋白N-末端氨基酸、半胱氨酸和賴氨酸殘基都位于其活性中心或活性中心附近,直接的PEG修飾會(huì)影響CVN與病毒表面糖蛋白gpl20的結(jié)合,從而影響其抗病毒活性。 本實(shí)驗(yàn)中,在CVN的N-末端接入了(GGGGS)3的親水柔性Linker序列(即LCVN),通過(guò)His6-SUMO的融合表達(dá)系統(tǒng),SUMO-LCVN蛋白在大腸桿菌中以可溶的形式表達(dá),表達(dá)量占菌體總蛋白的30%。SUMO-LCVN融合蛋白比SUMO-CVN蛋白對(duì)SUMO蛋白酶更敏感,能被SUMO蛋白酶充分酶切,因此LCVN蛋白的制備更加高效,更適合大規(guī)模生產(chǎn)。 分別以分子量為10KDa和20KDa的mPEG-ALD對(duì)LCVN的N-末端進(jìn)行定點(diǎn)修飾,對(duì)反應(yīng)pH、LCVN與mPEG-ALD的摩爾比進(jìn)行篩選；得到了最佳的PEG修飾條件。反應(yīng)時(shí)間對(duì)PEG修飾結(jié)果影響較小,室溫2h即可反應(yīng)完全。SP sepHarose陽(yáng)離子交換親和層析成功分離單PEG修飾產(chǎn)物(monoPEGyalted-LCVN),其純度95%。在納摩爾濃度范圍,LCVN、monoPEGyalted-LCVN與gp120蛋白有較高的親和力,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。體外抗HSV-1和HIV-1活性實(shí)驗(yàn)表明：LCVN是一種細(xì)胞毒性更低、活性更強(qiáng)的CVN的衍生物；monoPEGyalted-LCVN抗病毒活性得到一定程度的保持,細(xì)胞毒性顯著降低,能夠有效抑制HIV感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞的融合。 本研究成功制備了純度95%的重組LCVN蛋白及monoPEGyalted-LCVN, LCVN細(xì)胞毒性更低、活性更強(qiáng)；monoPEGyalted-LCVN細(xì)胞毒性顯著降低,納摩爾濃度范圍能有效抑制HIV感染細(xì)胞與未感染的融合,這位開(kāi)發(fā)基于CVN的新型、高效抗病毒藥物打下了基礎(chǔ)。
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圖片說(shuō)明： 個(gè)氨基酸殘基組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)含有10個(gè)B一對(duì)稱地分成A和B兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，中間有鉸鏈一定影響[l4];例如鉸鏈區(qū)突變體PSIG在突變體S52P在溶液中二聚體是非常穩(wěn)定的性能與天然蛋白完全一致，甚至晶體結(jié)構(gòu)N無(wú)翻譯后的修飾，其中有2個(gè)內(nèi)部二硫N成熟蛋白中的兩個(gè)二硫鍵分別位于第8V-N的氨基酸序列在1~50殘基和51一101以及16對(duì)具有直接同源性的殘基;這兩段立級(jí)結(jié)構(gòu)每個(gè)折疊相互之間都有眾多的接列之間鏈的交換形成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域是和力113，，4，16，，71。
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圖片說(shuō)明： 切后插入到表達(dá)載體PET3c中，，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET3c一SuMO一LcvN，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a，挑單克隆陽(yáng)性菌體，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和萬(wàn)由I和與BamHI雙酶切鑒定(如圖4.1所示)，對(duì)陽(yáng)性結(jié)果送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2D0150刃”250100圖4.1重組質(zhì)粒pET3c一SUMO一LCVN雙酶切鑒定及PCR鑒定 Fig4.1RestrictinnandPCRanalysisofreeombinantPlasmidPET3e一SUMO一LCVN M:DL2000DNAmarker;Lanel:PET3e一SUMO一LCVN腳del+BamHI;LaneZ:PCR 1.2SUMO一LCVN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)圖4.2是工程菌BLZI【pET3c一suMo一LcVN』經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)圖譜，可見(jiàn)經(jīng)誘導(dǎo)后，在分子量28kDa處出現(xiàn)明顯增粗的蛋白帶(泳道3)，與His6一SUMO一LCVN的理論分子量相符，超聲破碎后，目的蛋白位于菌體破碎后的上清中，為可溶性表達(dá)，凝膠經(jīng)光密度掃描，含量占菌體可溶性蛋白的30%(泳道4)。另外，工程菌BLZI[pET-SUMo一LcVNI經(jīng)30L的發(fā)酵罐發(fā)酵
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2513377