【摘要】： 目的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)成為當(dāng)今生命科學(xué)和生物技術(shù)研究的熱點(diǎn),這是因?yàn)樗哂凶晕腋潞投嗄芊只哪芰�。多年�?“成體組織中是否存在胚胎干細(xì)胞”一直是一個很有爭議的問題,很多實(shí)驗(yàn)室已報道可以從骨髓中分離出來ESCs樣的多能干細(xì)胞,這些細(xì)胞都表達(dá)ESCs特異性標(biāo)志Oct4基因,能像ESCs一樣無限分裂繁殖,而且可以分化成幾乎所有類型的細(xì)胞。但是對于這些原始細(xì)胞的來源和存在機(jī)制,人們并不清楚。因此,骨髓中是否存在ESCs就變成了一個很有爭議的問題。 之前的研究都是通過不同的方法從骨髓中分離、提取并培養(yǎng)這些ESCs樣的干細(xì)胞,而我們首次通過相反的方式直接將小鼠ESCs注入到小鼠的骨髓腔里,通過觀察ESCs在體內(nèi)的分布生長情況,從而思考體內(nèi)是否有這樣一個適宜ESCs生存的環(huán)境。 方法為了更好地追蹤ESCs在體內(nèi)的生長情況,我們新建兩株帶綠色熒光標(biāo)記(green fluorescent protein, GFP)的ESCs——oGFP+ESCs(C57BL／6xOct4／EGFP轉(zhuǎn)基因OG2小鼠)；和aGFP+ESCs(129／SvxCAG／EGFP轉(zhuǎn)基因C57BL／6-Tg小鼠)。oGFP+ESCs中GFP的表達(dá)受Oct4啟動子調(diào)控,Oct4表達(dá)時GFP才表達(dá)；aGFP+ESCs中GFP的表達(dá)受chicken-beta-actin啟動子調(diào)控,無論細(xì)胞分化與否,GFP均表達(dá)。為了避免了ESCs在體內(nèi)其它器官的阻滯和損失,我們直接將ESCs通過脛骨注射植入到同源的C57BL／6小鼠(分照射組和非照射組)骨鏈腔內(nèi)。 移植后,通過雙光子熒光顯微鏡來觀察GFP+細(xì)胞在小鼠骨髓腔里存活的時間和狀態(tài)。另在不同的時間點(diǎn),我們從移植小鼠的骨髓腔里再次分離出這些GFP+的細(xì)胞,采用建立ES細(xì)胞系的方法使這些Oct4+-GFP+細(xì)胞建成穩(wěn)定細(xì)胞系,并檢測這些新建細(xì)胞系的功能。通過基因芯片檢測來比較這些細(xì)胞系和母代ESCs在基因表達(dá)水平上的差異。另一方面,我們通過流式細(xì)胞學(xué)檢測和體外培養(yǎng)的方式,分析移植的ESCs在骨髓這種造血微環(huán)境下的分化特征。 結(jié)果通過雙光子熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)100天后,骨髓中仍然存在Oct4-GFP表達(dá)的類似ESCs的細(xì)胞。大多數(shù)GFP+細(xì)胞位于移植側(cè)脛骨的注射部位,也有少部分GFP+細(xì)胞位于注射骨對側(cè)的骨髓腔內(nèi)。在不同的時間點(diǎn),我們從移植小鼠的骨髓腔里分離出這些Oct4+-GFP+的細(xì)胞,建成穩(wěn)定細(xì)胞系。到目前為止,我們成功建立了8株細(xì)胞系,形態(tài)同ESCs。通過對這些Oct4+細(xì)胞系的功能性檢測發(fā)現(xiàn)它們具有與ESCs相似的特性,但這種細(xì)胞系生成嵌合鼠的嵌合率很低,且不能生殖系傳遞。芯片結(jié)果顯示這些細(xì)胞與母代ESCs比較,部分基因表達(dá)水平發(fā)生了改變,表觀遺傳學(xué)也發(fā)生了逐漸的變化。 另外,移植的ESCs在骨髓腔內(nèi)大多數(shù)分化成了非造血的細(xì)胞,形態(tài)多樣,與骨質(zhì)連接緊密,而僅有少部分分化成了造血細(xì)胞,并可進(jìn)入血循環(huán)。結(jié)論1)我們的研究首次通過直接將ESCs移植入小鼠骨髓腔來證實(shí)了成體環(huán)境中長期存在ESCs的可能性,對以后干細(xì)胞的應(yīng)用,在成體內(nèi)的發(fā)育和分化研究具有一定的提示作用； 2)由于原始的胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)可以長期存在,因此在使用ESCs或ESCs衍生物做細(xì)胞治療或移植過程中,安全性一定要長期關(guān)注； 3)胚胎干細(xì)胞在成體骨髓中存活一段時間后,逐漸發(fā)生了表觀遺傳學(xué)方面的變化,這種變化影響了ESCs的多能性改變,因此在以后細(xì)胞移植過程中,我們需要關(guān)注這些細(xì)胞表觀遺傳學(xué)方面的影響； 4)ESCs在骨髓腔內(nèi)存活一段時間后,大多數(shù)分化成了非造血細(xì)胞。我們的研究首次說明了ESCs在骨髓微環(huán)境的分化趨勢,對ESCs的分化潛能和周圍環(huán)境的關(guān)系以及ESCs的應(yīng)用具有一定的提示作用。
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圖片說明： 1.feeder細(xì)胞的形態(tài)和密度:feeder細(xì)胞很容易貼壁，復(fù)蘇后6小時基本貼壁牢固，這些細(xì)胞不增殖，只提供ESCs生長的養(yǎng)份，分裂細(xì)胞因子抑制ESC分化，因此需要合適密度的feeder細(xì)胞，太稀或太密，ESCs均容易分化，圖1一1中feeder細(xì)胞的密度較適用于小鼠ESCs的培養(yǎng)。圖1一1:典型的滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)和密度2.成功建立不同品系的帶GFP熒光標(biāo)記的小鼠胚胎干細(xì)胞系:通過不同品系的小鼠與相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠交配 :oGFP+Eses(e57BLz6XoeZ);aGrP+Eses(12叨SvXe57Bu6一Tg)。oorP+EsCs:GFp的表達(dá)受oct’啟動子調(diào)控，oct4表達(dá)時GFP才表達(dá) ;aGFP+ESCs:GFP的表達(dá)受chinken一p一actin啟動子和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子調(diào)控，，即無論細(xì)胞分化與否，Oct4均表達(dá)。取交配后 E3.5囊胚(GFP+)種于feeder上面，3一5天內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形成典型綠色克隆(圖1一2)，將綠色克隆挑出接種到預(yù)先鋪有feeder的96孔板里，一個孔一個克隆，通過逐步消化傳代擴(kuò)增，形成兩株穩(wěn)定的形態(tài)較好的小鼠胚胎干細(xì)胞系(圖1一3)。ESCs呈一個一個克隆生長，邊緣光滑，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密
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圖片說明： 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文(二)雙光子觀察GFP+細(xì)胞1.光譜學(xué)分析:GFP的發(fā)射光譜是一條類似正態(tài)分布的曲線(圖2一2)，最大峰值為 509nm，而如果是噪音或者自發(fā)熒光，它的光譜是沒有規(guī)律的或者一直很高呈一平線(圖2一3)。圖2一 2:GFP十細(xì)胞的發(fā)射光譜曲線圖2一3:自發(fā)熒光光譜曲線無規(guī)律2.雙光子觀察中，我們用glonln作為激發(fā)波長。兩個NDD頻道同時收集圖像，綠色NDD頻道的發(fā)射濾光器是495一54OIun，而紅色NDD頻道的發(fā)射濾光器是570一625run。在綠色NDD頻道可見，而在紅色NDD頻道不可見的信號，即為GFP信號。因此結(jié)合兩個NDD頻道的成像和光譜學(xué)分析
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 韋多;王彥;高選;沈蕓;徐凱;趙躍然;趙力新;陳子江;;小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞直接向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年05期

2 蔡耘;黃紹良;張緒超;黃永蘭;黃科;陳惠芹;李萍;;骨髓腔內(nèi)途徑臍血與間質(zhì)干細(xì)胞共移植對造血重建的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國病理生理雜志;2008年01期

本文編號：2513250