發(fā)布時間：2019-07-11 09:17

【摘要】： 目的: 培養(yǎng)擴增大鼠骨髓(bone marrow,BM)、人胎盤(placenta)間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs);探討其定向誘導分化為膽堿能樣神經元的有效條件。 材料方法: 1.間充質干細胞的分離培養(yǎng) 1.1大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng):使用全骨髓法將獲取的骨髓直接種植到含10%FBs+DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,置于37℃,體積分數為5%的CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔72h換液1次,7-10d首次傳代。 1.2.人胎盤間充質干細胞的酶消化法分離培養(yǎng):剪碎后先使用膠原酶Ⅱ消化后再用胰蛋白酶,反復吹打使成單細胞懸液和外植塊混合物,100目濾網過濾收集單細胞,離心獲得單個核細胞,懸浮于低糖DMEM培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2和100%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),隨后每3～4d換液1次,經3～4周可見成纖維樣細胞在瓶底匯合成片狀。 2.間充質干細胞向膽堿能樣神經元細胞分化誘導 2.1大鼠骨髓間充質干細胞向膽堿能樣神經元細胞分化誘導:取2～4代MSCs,實驗Ⅰ組:10%FBS(胎牛血清)誘導2d;換液為DMEM/F12加入bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)、2-ME(巰基乙醇)、RA(維甲酸)、NGF(神經生長因子)繼續(xù)誘導8d。實驗Ⅱ組:在Ⅰ組方案的基礎上加入EGF(表皮生長因子)、Heparin繼續(xù)誘導8d�？瞻讓φ战M使用DMEM/F12培養(yǎng)液不加任何誘導劑連續(xù)培養(yǎng)10d,。 2.2人胎盤間充質干細胞向膽堿能樣神經元細胞分化誘導:取4代胎盤間充質干細胞,實驗Ⅰ組:10μg/LbFGF+10%FBS(胎牛血清)誘導2d;換液為DMEM/F12加入bFGF、2-ME、RA、NGF繼續(xù)誘導19d。實驗Ⅱ組:在Ⅰ組方案的基礎上加入EGF(表皮生長因子)、Heparin繼續(xù)誘導19d�？瞻讓φ战M使用含DMEM/F12培養(yǎng)液不加任何誘導劑連續(xù)培養(yǎng)21d,。 3.倒置顯微鏡下觀察誘導不同天數后的形態(tài)變化,SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計分析。 4.取誘導的MSCs,采用RT-PCR檢測及凝膠電泳分析nestin,nurrl,chatmRNA的表達,均以β-actin作為內參照。 5.間接免疫熒光法檢測Nestin,ChAT,NeuN,AchE陽性細胞表達。 6.流式細胞儀檢測人胎盤間充質干細胞表面部分標志抗原成分及誘導分化后不同時間段的Nestin,ChAT,NeuN,AchE陽性細胞數量及向膽堿能樣神經元細胞分化率 7.ELISA方法檢測不同時間段的人胎盤間充質干細胞誘導分化后的上清液的終產物乙酰膽堿的表達含量 結果: 1.大鼠骨髓間充質干細胞向膽堿能樣神經元細胞分化誘導結果:骨髓間充質干細胞誘導后形態(tài)學變化:誘導后細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)閳A形或橢圓形,突起形成,胞間或細胞與間質形成連接或神經球,胞漿內分泌顆粒增加�？瞻讓φ战M第1、3、5、10天細胞形態(tài)變化率波動于1%左右,實驗組變化率明顯增高,差異有統(tǒng)計意義。誘導后的細胞高表達nestin、nurrl、chat mRNA,實驗組間基因表達相對強度比較有統(tǒng)計差異(P＜0.01)。免疫熒光法檢測顯示,實驗組Nestin,ChAT,NeuN,AchE陽性分化細胞率約50-80%,而空白對照組ChAT陽性分化細胞表達率僅約為1%。 2.人胎盤間充質干細胞向膽堿能樣神經元細胞分化誘導結果:誘導后的胎盤間充質干細胞細胞形態(tài)變化與骨髓間充質干細胞類似。流式細胞術檢測,人胎盤MSCs強表達透明質酸受體CD44和整合素家族成員CD29,陽性率分別為99.8%,99.7%;不表達造血干細胞標志CD34(4.8%)和CD45(0.9%),也不表達內皮細胞標志CD106(2.3%)。hPMSCs(人胎盤間充質干細胞)不表達HLA-DR(1.0%);14d誘導后的兩實驗組細胞均表達nestin、chatmRNA,實驗Ⅰ組(FMRN組)Nestin、AchE、ChAT,表達陽性率分別為29.7%,85.8%,24.5%;實驗Ⅱ組(FMRENH組)分別為76.3%,98.2%,10.4%,陰性對照組分別為1.9%,10.8%,4.5%。ELISA方法檢測示,對照組第4代胎盤MSCs、實驗Ⅰ、Ⅱ組誘導1、2、3周的上清乙酰膽堿濃度分別為0±4.6nmol/1、0±4.7 nmol/1、20±9.4 nmol/1:638.9±7.9 nmol/1、393.6±10.3nmol/1、905.1±10.1 nmol/1:39.2±26.6 nmol/1、82.1±23.2 nmol/1、234.9±19.2 nmol/l。組間比較差異明顯P＜0.01 結論: 1.骨髓間充質干細胞、人胎盤間充質干細胞能在體外培養(yǎng)擴增,并可以在誘導劑作用下,在體外誘導分化為具有合成及釋放降解乙酰膽堿能力的膽堿能樣神經元細胞,實驗Ⅰ組有較高的分化率。 2.人胎盤MSCs強表達CD44、CD29;不表達CD34、CD45(0.9%)、CD106、HLA-DR
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 撒亞蓮,李海標;川芎嗪誘導大鼠骨髓間質干細胞分化為神經元樣細胞的研究[J];解剖學報;2003年05期

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本文編號：2513048