發(fā)布時(shí)間：2019-05-14 19:53

【摘要】： 為了篩選微小隱孢子蟲黏附相關(guān)蛋白基因,提取微小隱孢子蟲總RNA并分離mRNA,通過反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,將EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端連到雙鏈cDNA的兩端,定向插入到T7 Select 10-3b載體,用包裝蛋白進(jìn)行包裝并對初始文庫進(jìn)行擴(kuò)增,構(gòu)建微小隱孢子蟲噬菌體展示文庫。用微小隱孢子蟲易感的Caco-2細(xì)胞和高免血清對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行篩選,并對篩選得到的部分蛋白質(zhì)進(jìn)行定位。 本試驗(yàn)構(gòu)建的微小隱孢子蟲T7噬菌體展示文庫未擴(kuò)增文庫的滴度為3.3×10~7pfu/mL,文庫容量為1.0×10~7個(gè)重組子,文庫重組率為94%,92%的插入片段大于300bp,擴(kuò)增后文庫滴度為3.1×10~(10)pfu/mL。用Caco-2細(xì)胞篩選到5個(gè)微小隱孢子蟲黏附相關(guān)蛋白質(zhì),其中1個(gè)為已知蛋白質(zhì)CP2,已有報(bào)道推測其參與子孢子與宿主上皮細(xì)胞的黏附過程。其余4個(gè)蛋白質(zhì)功能未知。用微小隱孢子蟲高免血清篩選到3個(gè)蛋白質(zhì),其中1個(gè)為已知蛋白質(zhì)CP2,另2個(gè)蛋白質(zhì)功能未知。對篩選出來的兩個(gè)蛋白質(zhì)基因(CP389和CP245)的部分編碼區(qū)進(jìn)行原核表達(dá),分別命名為rCP389和rCP245,通過免疫熒光定位證實(shí),CP389和CP245在卵囊壁和子孢子表面均有表達(dá),推測篩選得到的蛋白質(zhì)可能參與了子孢子與宿主的黏附過程。本研究為揭示隱孢子蟲的致病機(jī)制提供了依據(jù)。
[Abstract]:In order to screen the adhesion related protein gene of Cryptosporidium parvum, the total RNA of Cryptosporidium parvum was extracted and mRNA, was isolated and the viscous ends of EcoR 鈪，

本文編號：2477004