【摘要】： 目的: 1.擬建立穩(wěn)定的小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(decidual stromal cell, DSC)培養(yǎng)方法,觀察DSC形態(tài)特征和生物學(xué)特性。 2.在體外建立穩(wěn)定的從小鼠骨髓來源的單核細(xì)胞誘導(dǎo)成熟樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)的培養(yǎng)體系,觀察DC形態(tài)特征和生物學(xué)特性。 3.建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型,初步探討小鼠蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對成熟DC增殖的影響,為進(jìn)一步研究DC在誘導(dǎo)母胎免疫耐受中的作用打下良好的基礎(chǔ)。 方法: 1.選用孕齡6-8d的C57BL/6孕鼠蛻膜組織,采用胰蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶混合消化,進(jìn)行蛻膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;催乳素(prolactin, PRL)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定;RT-PCR檢測DSC表達(dá)的細(xì)胞因子和趨化因子。 2.應(yīng)用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(interleukin 4,IL-4)誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞,相差顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化;FACS檢測細(xì)胞表面分子;3H-TdR摻入法檢測DC刺激同種異體或同體T細(xì)胞增殖能力;ELISA檢測其分泌的細(xì)胞因子。 3.采用小鼠子宮DSC和成熟DC共培養(yǎng)技術(shù),建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型,觀察DSC對DC增殖的影響。 結(jié)果: 1.小鼠子宮DSC在接種24h后大部分已貼壁,貼壁生長的細(xì)胞成纖維母細(xì)胞狀, 5-7d后細(xì)胞融合成單層。每4-5d傳代1次,傳代的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,而傳代培養(yǎng)極性漸不明顯。PRL免疫組化顯示體外培養(yǎng)傳代后95%陽性細(xì)胞為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞大小形狀均一,染色特點為胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)小的棕色顆粒,且越近胞核染色越深。RT- PCR檢測DSC表達(dá)GM-CSF、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)、白介素-2(interleukin 2, IL-2)、白介素-10(interleukin-10, IL-10)等細(xì)胞因子;表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-2(Monocyte chemotactic protein-2, MCP-2)、單核細(xì)胞趨化蛋白-3(Monocyte chemotactic protein-3, MCP-3)、胸腺活化相關(guān)的趨化性因子(Thymus activation-related chemokine,TRAC)等趨化因子。 2.用GM-CSF+ IL-4細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)3d后,有細(xì)胞集落形成;培養(yǎng)第5d開始,一部分細(xì)胞從集落脫落,懸浮于培養(yǎng)基中,呈現(xiàn)樹枝狀不規(guī)則變化;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)后,成簇的細(xì)胞散開,大量的細(xì)胞脫落,多數(shù)為圓形或不規(guī)則形,表面有豐富的伸長毛刺的低密度大細(xì)胞。成熟DC高表達(dá)DC相對特異性標(biāo)志CD11c、共刺激分子CD80、CD86、MHCⅡ類分子Ia和Ⅰ類分子H-2Kb。DC具有強烈的激活T細(xì)胞增殖的能力;1000個DC,即可有效激發(fā)T細(xì)胞增殖。LPS刺激成熟8d DC與未經(jīng)LPS刺激5d DC,其刺激同種異體或同體T細(xì)胞增殖能力明顯增高,結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。并且在各組中隨著DC:T比例增加,其刺激T細(xì)胞增殖能力增強,結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)LPS刺激的成熟DC分泌細(xì)胞因子IL-12p70、IL-6、TNFa和IL-1b的水平明顯升高,與未經(jīng)LPS刺激的PBS組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.成熟DC能在DSC單層上繼續(xù)生長,沒有隨著培養(yǎng)時間的延長而走向自然凋亡,第15d鏡下觀察形成細(xì)胞集落,發(fā)生了克隆性增殖。 結(jié)論: 1.建立的混合酶消化全組分蛻膜的方法,簡化了DSC的提純程序,能獲得高純度的合乎實驗要求的DSC,具有經(jīng)濟(jì)、實用、方便、可靠的特點。 2.細(xì)胞因子組合GM-CSF+IL-4+LPS在體外具有誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的單核細(xì)胞分化為成熟DC的作用,我們建立的體外誘導(dǎo)小鼠骨髓單核細(xì)胞的方法可以獲得形態(tài)、表型和功能都非常典型的成熟DC,方法簡便。 3.小鼠子宮DSC組成的微環(huán)境能逆轉(zhuǎn)成熟DC的自然凋亡,使其重新獲得增殖的能力。
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【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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