【摘要】： 第一部分豬nectin-2分子的生物信息學(xué)預(yù)測、克隆及分析鑒定 [目的]證明豬nectin-2基因的存在，分析并克隆出nectin-2基因，明確其分子結(jié)構(gòu)特點及表達特性。 [方法]運用生物信息學(xué)方法從美國基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)獲得與人nectin-2基因同源的豬EST序列，通過RT-PCR、3’RACE等技術(shù)在豬內(nèi)皮細胞系SV-40-PED中驗證該序列的準確性，并研究其組織表達分布特點，利用體細胞雜交板(somatic cell hybridpanel，SCHP)技術(shù)對其進行染色體定位。根據(jù)反向PCR原理擴增該基因5’端調(diào)控區(qū)的未知序列。參照同源分子人PVR蛋白胞膜外區(qū)的三級結(jié)構(gòu)，利用生物序列分析軟件及數(shù)據(jù)庫構(gòu)建豬nectin-2蛋白胞膜外區(qū)的三維空間結(jié)構(gòu)模型。 [結(jié)果]通過克隆測序與同源性分析，發(fā)現(xiàn)豬存在necin-2分子，其包含α、δ2種剪接體，它們具有相同的胞膜外區(qū)序列與不同的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)序列，將此結(jié)果提交至美國基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)，并認定為我們新發(fā)現(xiàn)的基因，分別獲得登錄號EF195266和EU069826。necin-2在豬的各種組織細胞中廣泛表達，尤其在豬內(nèi)皮細胞中表達豐富。SCHP結(jié)果顯示豬necin-2定位于6號染色體q21區(qū)域。通過反向PCR技術(shù)從豬nectin-2α的5’端非編碼區(qū)延伸出371bp的未知序列。三維空間結(jié)構(gòu)顯示豬nectin-2蛋白胞膜外區(qū)形成V-C-C 3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，其中V樣結(jié)構(gòu)域由9個β折疊構(gòu)成。 [結(jié)論]生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)合使用，有助于豬的新基因的發(fā)現(xiàn)與鑒定。本研究證實了豬存在nectin-2基因的推測，明確了該基因相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息，為研究nectin-2的免疫學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 第二部分豬nectin-2胞膜外區(qū)融合蛋白的構(gòu)建、表達與純化 [目的]構(gòu)建具有模擬天然nectin-2分子與受體DNAM-1相結(jié)合能力的胞膜外區(qū)融合蛋白nectin-2ED-IgGFc。 [方法]利用RT-PCR擴增豬nectin-2胞膜外區(qū)基因片段，連接至T載體，測序無誤后，亞克隆至真核表達載體CD5lnegl，構(gòu)建出重組質(zhì)粒nectin-2ED-CD5lnegl。將重組質(zhì)粒和空載體CD5lnegl分別轉(zhuǎn)染至CHO細胞，用嘌呤霉素進行篩選；通過Western Blot、細胞免疫化學(xué)、免疫熒光和流式細胞術(shù)等方法檢測，鑒定出能穩(wěn)定表達融合蛋白nectin-2ED-IgGFc和IgGFc蛋白的細胞株。利用蛋白A+G瓊脂糖珠親和層析法分離、純化融合蛋白。 [結(jié)果]經(jīng)過雙酶切和測序鑒定，重組質(zhì)粒nectin-2ED-CD5lnegl構(gòu)建成功。嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定表達nectin-2ED-IgGFc融合蛋白和IgGFc蛋白的CHO細胞，從其細胞培養(yǎng)上清中分離、純化出高純度的融合蛋白。 [結(jié)論]成功構(gòu)建并表達出融合蛋白nectin-2ED-IgGFc，該蛋白可作為豬nectin-2與人DNAM-1相互作用研究的重要工具。 第三部分DNAM-1-nectin-2途徑介導(dǎo)入NK細胞殺傷豬內(nèi)皮細胞作用的研究 [目的]研究豬nectin-2與人DNAM-1異種受體配體之間的結(jié)合能力，建立能客觀有效地評價人NK細胞對豬內(nèi)皮細胞殺傷效果的實驗方法，比較不同人NK細胞系(包括NK92和YT細胞系)對豬內(nèi)皮細胞的異種殺傷能力。 [方法]利用流式細胞術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)檢測融合蛋白nectin-2ED-IgGFc與YT細胞系的DNAM-1之間的親和能力。通過Western Blot比較DNAM-1在NK92與YT細胞系中的表達水平，用流式細胞術(shù)檢測融合蛋白和抗DNAM-1中和性抗體與YT細胞結(jié)合的效率。建立用CFSE／PI雙染法檢測NK92和YT細胞系對豬內(nèi)皮細胞系(SV-40-PED)細胞毒作用的方法，比較NK92與YT細胞異種殺傷效應(yīng)的差異。 [結(jié)果]融合蛋白nectin-2ED-IgGFc能與人YT細胞表面的DNAM-1發(fā)生特異性結(jié)合。NK92與YT細胞DNAM-1的表達量無明顯差異。YT細胞在與終濃度為10μg／ml的抗DNAM-1中和性抗體于室溫孵育1h后，，抗體與YT細胞的結(jié)合率為48．53％。通過CFSE／PI雙染法檢測到，當效靶比為10：1，共同孵育時間為5、6和7小時后，對豬內(nèi)皮細胞系(SV-40-PED)的殺傷率人NK92細胞分別為44．68％、53．99％和57．44％，人YT細胞分別為20．44％、20．60％和26．71％。 [結(jié)論]證明了豬nectin-2與人DNAM-1發(fā)生特異性結(jié)合的能力，這是DNAM-1-nectin-2途徑發(fā)揮作用的重要前提。CFSE／PI雙染法能夠方便客觀地檢測NK細胞的殺傷效率。在殺傷條件完全相同時，NK92比YT細胞表現(xiàn)出更高的異種殺傷活性。以上結(jié)果為進一步研究DNAM-1-nectin-2信號途徑介導(dǎo)人NK細胞對豬內(nèi)皮細胞的殺傷作用奠定了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 王曉祺,譚巖,段秀梅,劉玲麗,方艷秋,姜艷芳,許淑芬,劉力華;流式細胞術(shù)檢測細胞毒方法的建立[J];中國免疫學(xué)雜志;2004年10期

本文編號：2476891