【摘要】： 目的： 通過研究不同濃度的阿侖膦酸鈉(Alendronate, ALN)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)增殖和成骨誘導(dǎo)分化能力的影響,評價不同濃度阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)液對hBMSCs成骨誘導(dǎo)分化的效率,從而初步確定阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化的合適濃度。為阿侖膦酸鈉聯(lián)合BMSCs的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù),為防治骨質(zhì)疏松(Osteoporosis, OP)提供一種新的思路。 方法： 1.運用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)hBMSCs； 2.倒置相差顯微鏡逐日觀察原代及傳代細(xì)胞的生長、增殖及形態(tài)特征,繪制生長曲線； 3.取生長狀態(tài)良好的第四代細(xì)胞,通過形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物等鑒定hBMSCs； 4.誘導(dǎo)hBMSCs分化為成脂肪細(xì)胞,鑒定本實驗所分離的hBMSCs具有多向分化能力； 5.取生長狀態(tài)良好的第四代細(xì)胞,分為實驗組(不同濃度的阿侖膦酸鈉,A-F組)、空白對照組(L-DMEM,G組)和陽性對照組(地塞米松,H組)各自誘導(dǎo)成骨分化。 6.放射免疫法檢測各組hBMSCs骨鈣素的分泌能力 7.實時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中Runx2和Osx mRNA的表達情況,并檢測經(jīng)成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后細(xì)胞內(nèi)脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)mRNA的表達情況。 8.統(tǒng)計方法對比分析得出結(jié)論。 結(jié)果： 1.第四代細(xì)胞CD29和CD44陽性表達率分別為100%和99.8%,CD31和CD45陽性表達率分別為0.8%和0.4%。流式細(xì)胞儀檢測證明本研究分離培養(yǎng)hBMSCs的方法可以獲得高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.hBMSCs體外誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞分化16d后,鏡下可見胞漿內(nèi)充滿圓形脂滴,油紅O染色陽性,經(jīng)qRT-PCR檢測有83.6±4.7%表達LPL,證實本實驗分離的hBMSCs具有多向分化能力。 3.hBMSCs誘導(dǎo)分化至第7天時,A-F組大部分細(xì)胞仍呈長梭形,G組部分細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變；A-F組細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素表達較低(0.03ng／ml～0.08ng／ml),而H組為0.14±0.06ng／m1；在A-F組分別有1.3%～2.5%和1.1～2.6%細(xì)胞表達Osx和Runx2 mRNA,在地塞米松誘導(dǎo)組約28.6±4.3%和29.2±5.1%細(xì)胞表達Osx和Runx2 mRNA。 4.hBMSCs誘導(dǎo)分化至第14天時,A-F組部分細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變,在A-D組為8%～12%,在E組和F組最明顯(20.7±1.4%和23.6±1.3%),G組為53.6±8.2%；A-F組細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素表達較第7天增加,E和F組增加最明顯(分別為0.27±0.09ng／ml和0.28±0.08ng／ml),與A-D組相比,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),H組為0.46±0.13ng／ml；與第7天時比較,Osx和Runx2 mRNA表達在A-F組均有明顯提高,尤其以E和F組明顯(OsxmRNA：22.1±5.6%和25.6±5.3%,Runx2 mRNA：25.2±5.3%和27.8±5.8%),在地塞米松組Osx mRNA為55.8±10.2%,Runx2 mRNA為53.2±9.8%。 5.hBMSCs誘導(dǎo)分化至第21d時,A-F組細(xì)胞誘導(dǎo)分化率均較第7d和14d進一步提高,在地塞米松誘導(dǎo)分化組約84.2±10.6%細(xì)胞呈圓形。細(xì)胞誘導(dǎo)分化至第21d時,A-F組細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量進一步增加,骨鈣素含量增加趨勢與細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化率增加趨勢相似。hBMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化21d時,A-F組細(xì)胞Osx和Runx2 mRNA表達量進一步增加,E組和F組超過50%細(xì)胞陽性表達,高于其他阿倫磷酸鈉工作液誘導(dǎo)組；而在地塞米松誘導(dǎo)組,分別有87.5±11.5%和85.9±10.2%細(xì)胞表達Osx和Runx2 mRNA。 6.在陰性對照組,始終未見有細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、骨鈣素表達和Osx和Runx2 mRNA表達。 結(jié)論： 1.采用全骨髓貼壁法可獲得穩(wěn)定、均質(zhì)性良好的hBMSCs,并具有多向分化能力； 2.ALN能促進hBMSCs增殖和骨向分化,1×10-6mol／L為其誘導(dǎo)分化的合適濃度。
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【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2473671