【摘要】： 近年來的研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織除能量儲存外,尚具有活躍的內(nèi)分泌功能。在代謝狀態(tài)改變或接受外界刺激時,脂肪組織可分泌多種具有生理活性的蛋白質(zhì),即脂肪細胞因子,包括瘦素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、抵抗素、白細胞介素6(IL-6)、脂聯(lián)素(adiponectin,ADPN)等。這些激素參與了神經(jīng)、內(nèi)分泌與免疫網(wǎng)絡的調(diào)節(jié),尤其對能量代謝調(diào)節(jié)具有重要的作用。 脂聯(lián)素作為一種脂肪細胞因子,具有重要的生理功能:改善糖脂代謝及胰島素抵抗;通過抑制人類主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs)表面的血管細胞粘附分子及細胞間粘附分子等的表達,起到抗動脈粥樣硬化的作用;可使肥胖者個體質(zhì)量減輕;通過抑制巨噬細胞前體細胞的生成和成熟巨噬細胞的功能調(diào)節(jié)炎癥反應。因此,脂聯(lián)素與胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病等具有密切聯(lián)系。近年來的研究還表明,脂聯(lián)素可直接或間接影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 在對脂聯(lián)素多年的研究中發(fā)現(xiàn),低脂聯(lián)素水平不僅與胰島素抵抗及2型糖尿病相關,低脂聯(lián)素血癥還可出現(xiàn)在心血管疾病、高血壓、血脂異常中。血清脂聯(lián)素水平的檢測可以作為代謝性疾病診斷及治療評價的指標,而補充重組脂聯(lián)素或增加內(nèi)源性脂聯(lián)素的分泌則為胰島素抵抗相關疾病的預防和治療提供了一種新的思路與手段。 目前,國內(nèi)外已有一些研究應用多種蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建重組脂聯(lián)素,包括原核及真核表達系統(tǒng)。其中原核表達體系因其成本低,操作簡便以及產(chǎn)量高等眾多優(yōu)點而被廣泛應用。本研究所采用的表達載體pQE-30Xa是Qiagen公司提供的一種高效表達和純化外源蛋白的原核表達系統(tǒng),相對于其他載體具有很多優(yōu)勢,目前國內(nèi)尚未見使用該載體獲得脂聯(lián)素蛋白的相關報道。 研究目的: 1.克隆人脂聯(lián)素目的基因,構(gòu)建pQE-30Xa/ADPN原核表達載體。 2.轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli M15[pREP4]進行重組蛋白的表達,鑒定表達產(chǎn)物。 3.優(yōu)化表達條件,以期建立高效表達的技術流程。 實驗方法: 1.從人的脂肪組織中提取總RNA,利用RT-PCR的方法得到人脂聯(lián)素基因cDNA序列,構(gòu)建模板質(zhì)粒;自行設計引物一對,經(jīng)PCR擴增人脂聯(lián)素基因完全編碼序列并使兩端加上雙酶切位點,構(gòu)建pMD18-T/ADPN重組克隆質(zhì)粒;pMD18-T/ADPN與pQE-30Xa質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BamHI與HindIII雙酶切后,用T_4DNA連接酶進行連接,構(gòu)建重組表達載體pQE-30Xa/ADPN。 2.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入M15[pREP4]表達菌株中,IPTG誘導表達;提取包涵體,SDS-PAGE及Western blot鑒定表達產(chǎn)物;從誘導時間、溫度及誘導劑濃度三方面摸索最適表達條件。 3.按照優(yōu)化條件進行蛋白質(zhì)的大量表達;在變性條件下利用His Band Kit純化目的蛋白;PAPIB法梯度透析復性,SDS-PAGE鑒定蛋白純度;Bradford法進行蛋白定量分析;MTS細胞增殖實驗檢測獲得目的蛋白的生物學活性。 實驗結(jié)果: 1.成功構(gòu)建重組表達載體pQE-30Xa/ADPN,經(jīng)測序證實插入的目的片段無誤。 2.脂聯(lián)素目的蛋白在E.coli.M15菌株中獲得了表達,其中誘導劑IPTG終濃度為0.6mM、溫度為37℃、誘導表達6小時后所獲得的蛋白含量相對較高。 3.經(jīng)His Band Kit純化后,可獲得單一的脂聯(lián)素目的蛋白條帶,蛋白純化效果較好;蛋白表達效率約為24.8%,產(chǎn)量約為330μg/100ml LB培基;經(jīng)MTS實驗證實獲得的重組蛋白具有生物活性。 實驗結(jié)論: 成功構(gòu)建了人脂聯(lián)素原核表達載體pQE-30Xa/ADPN,并在E.coli.M15菌株中獲得了表達,且獲得的重組蛋白具有生物學活性。pQE-30Xa原核表達系統(tǒng)是一個高效、快速構(gòu)建重組脂聯(lián)素蛋白的良好選擇。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346

【參考文獻】

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1 周黎 ,柯傳奎;基因工程藥物研究現(xiàn)狀與對策[J];生命科學儀器;2004年01期

2 崔進梅,宋磊,鄧學箴,潘顯玲;基因工程藥物的表達系統(tǒng)及發(fā)展狀況[J];齊魯藥事;2005年02期

3 胡小波,張育堅,張惠堂,楊勝利,龔毅;脂肪組織特異表達的脂連蛋白(Adiponectin)及其球狀區(qū)的克隆表達及體內(nèi)活性的檢測(英文)[J];生物化學與生物物理學報;2003年11期

4 劉宏磊;李希;宋后燕;湯其群;;人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域的表達、純化和功能鑒定[J];復旦學報(醫(yī)學版);2006年01期

5 張平武,李育陽;新型酵母表達系統(tǒng)的研究[J];生物技術通訊;1999年04期

6 劉德敏;楊莉麗;孫穎;張捷;;人脂聯(lián)素基因的克隆及在大腸桿菌中的表達[J];天津醫(yī)藥;2006年03期

7 吳海婭;賈偉平;魏麗;陸俊茜;包玉倩;項坤三;;肥胖及2型糖尿病患者血清視黃醇結(jié)合蛋白4水平的變化及其臨床意義[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2006年03期

8 李丙蓉;鄧華聰;蘭麗珍;鄭宏庭;劉金波;;人脂聯(lián)素基因真核表達載體的構(gòu)建及在HEK293細胞中的表達[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2006年05期

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本文編號：2473795