【摘要】： 脂肪代謝異常,如肥胖癥(Obesity)和高脂血癥(Hyperlipidemia)等疾病已成為嚴(yán)重危害人民健康的常見疾病之一。脂肪(Fat)是機(jī)體能量儲(chǔ)存的一種重要方式,細(xì)胞內(nèi)中性脂肪,如甘油三酯(Triglyceride,TG)和膽固醇酯(Cholesterol Ester,CE),主要以脂滴(Lipid Droplet, LD)的形式存在,脂滴廣泛地存在于多種組織細(xì)胞中,如脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和肌肉細(xì)胞等。脂滴的表面是為單層磷脂結(jié)構(gòu),并鑲嵌著多種脂滴相關(guān)蛋白(Lipid Droplet Associated Proteins)。脂滴相關(guān)蛋白在脂滴的分解、合成和融合過程中具有重要的作用。PAT家族蛋白在脂滴代謝過程中具有重要作用。1990年人們發(fā)現(xiàn)了脂滴表面的第一個(gè)蛋白Perilipin,此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)ADRP、TIP47、S3-12、Vimentin、Caveolin-1、CGI-58等許多蛋白也位于脂滴的表面,這些蛋白統(tǒng)稱為脂滴相關(guān)蛋白。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法應(yīng)用于脂滴表面蛋白的分析,大大提高了脂滴相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)的速度。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的分析,目前將脂滴相關(guān)蛋白主要分成三類:一類是與脂滴特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白,一類是與脂質(zhì)代謝有關(guān)的酶類或轉(zhuǎn)運(yùn)體,還有一類是相關(guān)資料過少而尚未分類的蛋白。一些研究發(fā)現(xiàn),在基礎(chǔ)狀態(tài)和激活狀態(tài)時(shí),都位于脂滴表面的結(jié)構(gòu)蛋白有Perilipin、S3-12、Vimentin和ADRP;而TIP47、Caveolin-1和Tubulin只在刺激狀態(tài)下出現(xiàn)在脂滴表面。不同條件下脂滴表面的蛋白種類和數(shù)量發(fā)生變化,提示這些蛋白可能是以脂滴表面為平臺(tái)來發(fā)揮對(duì)脂滴代謝的調(diào)節(jié)作用。OXPAT是Perilipin的同源蛋白,但其主要分布于脂肪分解代謝速度較快的組織細(xì)胞中,如肝細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。目前的研究發(fā)現(xiàn),OXPAT能夠激活PPAR途徑,而促進(jìn)細(xì)胞中脂肪酸的分解代謝。 1.在本研究中,我們利用OXPAT特異性引物從小鼠肝臟的cDNA文庫中克隆了OXPAT基因,經(jīng)測序,與Genebank公布的一致。同時(shí),我們構(gòu)建了OXPAT與凝血素( Hemagglutinin , HA )基因融合表達(dá)質(zhì)粒pCMV5-HA-OXPAT。通過轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,利用Bodipy 493/503進(jìn)行脂滴染色,經(jīng)熒光顯微檢測,我們發(fā)現(xiàn)OXPAT定位于脂滴表面,該結(jié)果與公布的研究結(jié)果一致。 2.我們利用AdEasy-1腺病毒系統(tǒng),構(gòu)建了攜帶OXPAT的腺病毒。首先,通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建pShuttle-HA-OXPAT質(zhì)粒。pShuttle-HA-OXPAT質(zhì)粒經(jīng)Pme I線性化后,與pAdEasy-1質(zhì)粒在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行重組,獲得pAd-HA-OXPAT質(zhì)粒。利用Pac I線性化pAd-HA-OXPAT,采用Lipofectacmine 2000轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在培養(yǎng)的第9天出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),收集細(xì)胞,反復(fù)凍融裂解細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的腺病毒。采用293T細(xì)胞測定病毒滴度,結(jié)果表明病毒的滴度大于2×109/ml,并能夠有效在293T細(xì)胞中表達(dá)。 3.我們研究發(fā)現(xiàn)OXPAT能夠降低肝細(xì)胞中脂肪的含量和減小脂滴的體積。我們采用肝臟灌注和膠原酶消化的方法,分離小鼠的肝臟細(xì)胞,并在體外進(jìn)行培養(yǎng),分離的肝細(xì)胞的存活率大于95%。我們利用攜帶OXPAT的腺病毒感染體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞,采用Western Blot檢測OXPAT的表達(dá),通過對(duì)肝細(xì)胞脂形態(tài)的觀察,我們發(fā)現(xiàn),OXPAT能夠減小脂滴的體積,同時(shí)肝細(xì)胞中脂肪含量減少。 綜上所述,本研究從小鼠肝臟cDNA文庫中克隆了OXPAT基因,并在COS7細(xì)胞中確定了其亞細(xì)胞定位。成功地構(gòu)建了攜帶OXPAT的腺病毒,在體外成功地培養(yǎng)了小鼠原代肝細(xì)胞,并利用腺病毒感染肝細(xì)胞確定OXPAT對(duì)肝細(xì)胞脂肪含量和脂滴形態(tài)的影響。本研究為研究OXPAT在肝臟中的功能及其機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R361

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉芳;LSDP5在脂肪代謝中功能的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

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本文編號(hào)：2473545