【摘要】： 脂肪代謝異常,如肥胖癥(Obesity)和高脂血癥(Hyperlipidemia)等疾病已成為嚴重危害人民健康的常見疾病之一。脂肪(Fat)是機體能量儲存的一種重要方式,細胞內中性脂肪,如甘油三酯(Triglyceride,TG)和膽固醇酯(Cholesterol Ester,CE),主要以脂滴(Lipid Droplet, LD)的形式存在,脂滴廣泛地存在于多種組織細胞中,如脂肪細胞、肝細胞、腎上腺皮質和肌肉細胞等。脂滴的表面是為單層磷脂結構,并鑲嵌著多種脂滴相關蛋白(Lipid Droplet Associated Proteins)。脂滴相關蛋白在脂滴的分解、合成和融合過程中具有重要的作用。PAT家族蛋白在脂滴代謝過程中具有重要作用。1990年人們發(fā)現了脂滴表面的第一個蛋白Perilipin,此后陸續(xù)發(fā)現ADRP、TIP47、S3-12、Vimentin、Caveolin-1、CGI-58等許多蛋白也位于脂滴的表面,這些蛋白統稱為脂滴相關蛋白。近年來蛋白質組學的研究方法應用于脂滴表面蛋白的分析,大大提高了脂滴相關蛋白發(fā)現的速度。通過蛋白質組學的分析,目前將脂滴相關蛋白主要分成三類:一類是與脂滴特異結合的結構蛋白,一類是與脂質代謝有關的酶類或轉運體,還有一類是相關資料過少而尚未分類的蛋白。一些研究發(fā)現,在基礎狀態(tài)和激活狀態(tài)時,都位于脂滴表面的結構蛋白有Perilipin、S3-12、Vimentin和ADRP;而TIP47、Caveolin-1和Tubulin只在刺激狀態(tài)下出現在脂滴表面。不同條件下脂滴表面的蛋白種類和數量發(fā)生變化,提示這些蛋白可能是以脂滴表面為平臺來發(fā)揮對脂滴代謝的調節(jié)作用。OXPAT是Perilipin的同源蛋白,但其主要分布于脂肪分解代謝速度較快的組織細胞中,如肝細胞和肌肉細胞。目前的研究發(fā)現,OXPAT能夠激活PPAR途徑,而促進細胞中脂肪酸的分解代謝。 1.在本研究中,我們利用OXPAT特異性引物從小鼠肝臟的cDNA文庫中克隆了OXPAT基因,經測序,與Genebank公布的一致。同時,我們構建了OXPAT與凝血素( Hemagglutinin , HA )基因融合表達質粒pCMV5-HA-OXPAT。通過轉染COS7細胞,利用Bodipy 493/503進行脂滴染色,經熒光顯微檢測,我們發(fā)現OXPAT定位于脂滴表面,該結果與公布的研究結果一致。 2.我們利用AdEasy-1腺病毒系統,構建了攜帶OXPAT的腺病毒。首先,通過分子生物學手段構建pShuttle-HA-OXPAT質粒。pShuttle-HA-OXPAT質粒經Pme I線性化后,與pAdEasy-1質粒在大腸桿菌BJ5183中進行重組,獲得pAd-HA-OXPAT質粒。利用Pac I線性化pAd-HA-OXPAT,采用Lipofectacmine 2000轉染AD293細胞。轉染的細胞在培養(yǎng)的第9天出現細胞病變效應(CPE),收集細胞,反復凍融裂解細胞,收集細胞裂解產物中的腺病毒。采用293T細胞測定病毒滴度,結果表明病毒的滴度大于2×109/ml,并能夠有效在293T細胞中表達。 3.我們研究發(fā)現OXPAT能夠降低肝細胞中脂肪的含量和減小脂滴的體積。我們采用肝臟灌注和膠原酶消化的方法,分離小鼠的肝臟細胞,并在體外進行培養(yǎng),分離的肝細胞的存活率大于95%。我們利用攜帶OXPAT的腺病毒感染體外培養(yǎng)的原代肝細胞,采用Western Blot檢測OXPAT的表達,通過對肝細胞脂形態(tài)的觀察,我們發(fā)現,OXPAT能夠減小脂滴的體積,同時肝細胞中脂肪含量減少。 綜上所述,本研究從小鼠肝臟cDNA文庫中克隆了OXPAT基因,并在COS7細胞中確定了其亞細胞定位。成功地構建了攜帶OXPAT的腺病毒,在體外成功地培養(yǎng)了小鼠原代肝細胞,并利用腺病毒感染肝細胞確定OXPAT對肝細胞脂肪含量和脂滴形態(tài)的影響。本研究為研究OXPAT在肝臟中的功能及其機制提供了研究基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R361

【共引文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 劉芳;LSDP5在脂肪代謝中功能的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

，

本文編號：2473545