【摘要】： 目的:神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells,NSCs)是具有分化為神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力,可自我更新并提供腦組織細(xì)胞的干細(xì)胞。Reynods和Richards等于1992年首次從成年動物腦中培養(yǎng)出了具有NSCs特性的細(xì)胞,之后科學(xué)家發(fā)現(xiàn)成人的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中都有NSCs的存在,NSCs的出現(xiàn)為神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病的功能重建以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷如腦、脊髓損傷的修復(fù)帶來了希望。但無論是體外還是體內(nèi)研究的結(jié)果,NSCs分化為神經(jīng)元的比例都明顯低于膠質(zhì)細(xì)胞,致使難以達(dá)到理想的替代因損傷和疾病等原因造成的神經(jīng)元缺失的目的。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)是來源于骨髓的多潛能干細(xì)胞,體外培養(yǎng)具有粘附特性及克隆樣增殖特征,其主要功能是支持和營養(yǎng)造血細(xì)胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)BMSCs能分泌許多具有神經(jīng)保護和修復(fù)作用的細(xì)胞因子,如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素(IL)、轉(zhuǎn)化生長因子(TNF)等,而且這些細(xì)胞因子對NSCs的存活、增殖以及分化也有一定影響。我們已證實BMSCs能夠誘導(dǎo)中腦NSCs分化為高比例神經(jīng)元,并且是BMSCs分泌至培養(yǎng)液中的可溶性分子(如細(xì)胞因子等)在這一過程中發(fā)揮了重要作用,但究竟是什么可溶性分子在起作用目前尚不清楚。本研究旨在通過用Neurobasal作為BMSCs的條件培養(yǎng)液(即Neurobasal Conditioned Medium,N-CM),將其分段之后分別培養(yǎng)NSCs,初步篩選出對NSCs分化具有調(diào)節(jié)作用的BMSCs條件培養(yǎng)液,再經(jīng)過含有19種大鼠細(xì)胞因子抗體的蛋白質(zhì)微陣列檢測,確定了其中所含的部分細(xì)胞因子,初步探討了BMSCs調(diào)節(jié)NSCs分化的機制。 方法:常規(guī)方法提取SD青年期大鼠BMSCs以及新生大鼠的中腦NSCs。將3-6代的BMSCs接種于25ml培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞鋪滿瓶底面積的約85%后,棄培養(yǎng)液,更換為Neurobasal培養(yǎng)液6 ml,培養(yǎng)24 h后收集上清,離心后上清液即為N-CM,-800C保存?zhèn)溆?共收集300ml。將N-CM解凍混勻后,經(jīng)超濾濃縮分為大于5KDa(N-CM5KDa)和小于5KDa (N-CM 5KDa)組兩部分,用這兩部分培養(yǎng)液分別培養(yǎng)NSCs,實驗共分為4組:(1) Neurobasal組:用Neurobasal培養(yǎng)液培養(yǎng)NSCs。(2) N-CM組:用N-CM培養(yǎng)NSCs。(3)N-CM5KDa組:用分子量大于5KDa的N-CM培養(yǎng)NSCs。(4)N-CM5KDa組:用分子量小于5KDa的N-CM培養(yǎng)NSCs。于分化第3天進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài),并且通過細(xì)胞計數(shù)確定其中能調(diào)節(jié)NSCs分化的部分進(jìn)行大鼠細(xì)胞因子抗體芯片檢測。結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,所有計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組之間采用t檢驗進(jìn)行顯著性分析。 結(jié)果:1.不同培養(yǎng)基對NSCs分化的影響:(1) Neurobasal組:細(xì)胞總體生長狀況很差,細(xì)胞核多有固縮、破碎,MAP-2陽性的神經(jīng)元稀少,而且突起不明顯,神經(jīng)元大多聚集在干細(xì)胞球的周圍。NG2陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起長度較短。GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多。(2) N-CM組:細(xì)胞生長狀況較好,胞核比較均一,很少有破碎,MAP-2陽性的神經(jīng)元較Neurobasal組多,且著色深,突起明顯。NG2陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起較長,熒光著色較亮。GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有所減少。(3)N-CM5KDa組:細(xì)胞生長狀況良好,細(xì)胞核大小均一、飽滿,MAP-2陽性的神經(jīng)元占多數(shù),著色明顯,突起較長,神經(jīng)元大多可以遷移到離干細(xì)胞球較遠(yuǎn)的距離。NG2陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起較長,熒光著色更亮。GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少。(4)N-CM5KDa組:細(xì)胞生長狀況極差,第3天染色時大部分細(xì)胞已死亡,未進(jìn)行細(xì)胞染色。 2.各組細(xì)胞計數(shù)以及統(tǒng)計學(xué)結(jié)果:(1)分化為MAP-2陽性神經(jīng)元的計數(shù):N-CM組NSCs分化為神經(jīng)元的比例(22.16±9.11%)高于Neurobasal組(17.00±7.69%),結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.021,p0.05),說明N-CM可以誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化,而N-CM5KDa組(34.24±15.94%)高于N-CM組(p=0.0006,p0.01),說明N-CM大于5KDa的部分在這一過程中起主要作用。(2)分化為NG2陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的計數(shù):N-CM組NSCs分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例(25.82±7.79%)高于Neurobasal組(21.32±9.09%),結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.044,p0.05),而N-CM5KDa組(41.01±8.88%)高于N-CM組(p=0.000,p0.01),結(jié)果有顯著性差異,說明N-CM可以誘導(dǎo)NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞方向,并且N-CM大于5KDa的部分在這一過程中發(fā)揮主要作用。(3)分化為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的計數(shù):N-CM5KDa組NSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例(23.10±13.57%)低于于Neurobasal組(37.99±10.75% p=0.000,p0.01)和N-CM組(35.07±8.96% p=0.001,p0.01),結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)差異,但Neurobasal組和N-CM組的星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.611,p0.05),說明N-CM5KDa對NSCs的分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞有抑制作用。 3.蛋白質(zhì)微陣列分析使用含有19種細(xì)胞因子抗體的蛋白質(zhì)微陣列檢測N-CM大于5KDa組和對照組(Neurobasal5KDa組),其結(jié)果表明,與對照組相比,N-CM5KDa組有7種細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)了1.5倍,分別為中性粒細(xì)胞趨化因子-3、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、干擾素-γ、白細(xì)胞介素-1α、單核細(xì)胞的趨化蛋白-1、金屬蛋白酶組織抑制劑-1和血管內(nèi)皮生長因子。沒有表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞因子。 結(jié)論:本研究以Neurobasal作為BMSCs的條件培養(yǎng)液,初步探討了BMSCs調(diào)節(jié)NSCs分化的細(xì)胞因子機制。研究證實:1、BMSCs分泌的可溶性分子對NSCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞有促進(jìn)作用并促進(jìn)其成熟,還對NSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞有抑制作用,其中分子量大于5KDa的細(xì)胞因子起關(guān)鍵作用。2、BMSCs分泌的可溶性分子中CINC-3、CNTF、IFN-γ等7種細(xì)胞因子可能在這一調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮效應(yīng)。3、BMSCs分泌的可溶性分子可以促進(jìn)NSCs分化的為神經(jīng)元遷移較遠(yuǎn)的距離。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2471470