【摘要】： 當(dāng)前,高致病性人禽流感H5N1已在15個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生,死亡率高,特別是印尼家族性感染被美國(guó)科學(xué)家證實(shí)為人傳染人事例后,使得大流行流感防控形勢(shì)異常嚴(yán)峻。WHO預(yù)言,下一次流感大流行不是有和無的問題,而是早和晚的問題。因此,做好大流行流感疫苗研發(fā)和關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)的研究,已成為世界各國(guó)應(yīng)對(duì)流感大流行采取的重大舉措。 疫苗免疫接種是控制高致病性人禽流感最有效而經(jīng)濟(jì)的手段之一,但面臨著高致病性人禽流感病毒H5N1毒株變異、雞胚生產(chǎn)疫苗原料來源受限、注射接種繁復(fù)等重大問題。因此WHO要求全球加快大流行流感疫苗研發(fā)和關(guān)鍵技術(shù)儲(chǔ)備研究進(jìn)程,為應(yīng)對(duì)流感大流行做好充分的準(zhǔn)備。 目前,高致病性人禽流感病毒H5N1感染主要分布在亞洲,特別是印尼、越南和中國(guó),對(duì)其分離的毒株進(jìn)行血清學(xué)、致病性和基因結(jié)構(gòu)等分析表明,高致病性人禽流感病毒H5N1具有高度變異的特性,就中國(guó)分離的毒株存在南北之分。因此,WHO要求各國(guó)開展大流行流感原型疫苗的研究。目前大流行流感疫苗的研究重點(diǎn)主要集中在滅活全病毒疫苗、裂解疫苗、減毒噴鼻疫苗、亞單位疫苗等。其中裂解疫苗具有不可多得的優(yōu)勢(shì):與全病毒滅活疫苗僅可用于成年人的特點(diǎn)比較,可廣泛用于各類人群,尤其是作為禽流感病毒的高危人群--老人和12歲以下的兒童;不存在減毒疫苗毒力恢復(fù)的缺點(diǎn),更安全;較亞單位疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性和制備簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。目前,大流行流感裂解疫苗已成為世界著名疫苗企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)介入的重點(diǎn),并取得了階段性成果,為流感大流行作好了充分的準(zhǔn)備。 基于大流行流感裂解疫苗應(yīng)對(duì)流感大流行具有不可多得的優(yōu)勢(shì),我們?cè)趪?guó)內(nèi)率先成功研發(fā)了大流行流感裂解疫苗,解決了我國(guó)“無”和應(yīng)急的問題。同時(shí)圍繞大流行流感疫苗關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái):針對(duì)高致病性人禽流感病毒H5N1不斷變異,需要運(yùn)用RG技術(shù)來快速制備疫苗株的問題、雞胚生產(chǎn)原料來源和質(zhì)量的問題、注射免疫不能產(chǎn)生全面免疫應(yīng)答和接種復(fù)雜的問題進(jìn)行了研究,其研究進(jìn)展如下: 大流行流感裂解疫苗的研制:我們從美國(guó)CDC引進(jìn)大流行流感疫苗株VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1),該疫苗株是利用反向遺傳學(xué)技術(shù),將高致病性人禽流感病毒A/Viet Nam/1203/2004 (H5N1)的HA、NA基因定點(diǎn)突變后和PR8的6個(gè)內(nèi)部基因進(jìn)行重組,得到大流行流感疫苗減毒株。 開展了大流行流感裂解疫苗種子批庫(kù)的研究。通過SPF雞胚傳代建立了大容量符合疫苗生產(chǎn)的原始種子批、主種子批和工作種子批庫(kù)。分別對(duì)大流行流感疫苗各種子批進(jìn)行了血凝滴度的檢測(cè)、病毒型別的檢定、EID50、無菌實(shí)驗(yàn)、支原體檢測(cè)、外原因子檢測(cè)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)證實(shí)建立的原始種子批、主種子批和工作種子批庫(kù)具有安全、有效和穩(wěn)定,符合WHO規(guī)定大流行流感疫苗生產(chǎn)的要求。 開展了大流行流感裂解疫苗原液生產(chǎn)的研究。通過健康雞胚培養(yǎng)、收獲、滅活、裂解大流行流感裂解疫苗病毒,制備疫苗生產(chǎn)裂解病毒抗原。實(shí)驗(yàn)表明病毒培養(yǎng)溫度為33℃、培養(yǎng)時(shí)間為52h,病毒滅活采用1:4000的甲醛20～25℃滅活72h,病毒的純化使用凝膠過濾Sepharose 4 Fast Flow,病毒裂解選擇濃度為0.5%的Triton X-100,室溫作用2.0 h,建立了疫苗生產(chǎn)的最佳生產(chǎn)工藝,制備了大流行流感裂解疫苗原液。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗成品和有效性的研究。選用鋁鹽佐劑,采用動(dòng)物模型和抗原吸附率檢測(cè)進(jìn)行鋁佐劑濃度的確定,確定的鋁佐劑濃度為1.2mg/ml。選用3.75、7.5、15.0、30.0、45.0、60.0、75.0、90.0μg/0.5ml 8個(gè)疫苗劑量組,分別肌肉免疫小鼠和豚鼠,對(duì)疫苗免疫原性進(jìn)行了初步研究。通過血凝抑制實(shí)驗(yàn)來篩選疫苗的有效劑量,結(jié)果表明加鋁鹽佐劑的7.5、15.0、30.0μg/0.5ml是最佳的疫苗劑量組。我們同時(shí)對(duì)小鼠和豚鼠免疫一針和兩針時(shí)的免疫效果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,表明免疫兩針效果明顯優(yōu)于一針。因此,確定的大流行流感疫苗臨床試驗(yàn)為7.5、15.0、30.0μg/0.5ml成品劑量組,免疫兩針,為臨床研究提供了依據(jù)。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗安全性和穩(wěn)定性的研究。通過動(dòng)物過敏實(shí)驗(yàn)、異常毒性實(shí)驗(yàn)、急性毒性實(shí)驗(yàn)、熱源質(zhì)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明大流行流感裂解疫苗無毒性,使用安全。將大流行流感裂解疫苗成品置2～8℃、室溫(22～25℃)、37℃,通過解吸附單擴(kuò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗原含量,免疫Balb/c小鼠測(cè)定疫苗效力(中和抗體),通過pH儀檢測(cè)pH值,外觀的觀察來鑒定疫苗穩(wěn)定性,并通過疫苗加速實(shí)驗(yàn),證明制備的大流行流感裂解疫苗可在2～8℃保存兩年以上。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗Ⅰ期臨床研究,通過雙盲實(shí)驗(yàn)完成了疫苗安全性、有效性研究,實(shí)驗(yàn)證明制備的疫苗安全、有效。 大流行流感疫苗關(guān)鍵技術(shù)的研究:圍繞大流行流感疫苗研發(fā)中的疫苗毒株、培養(yǎng)介質(zhì)和免疫途徑的關(guān)鍵技術(shù)問題進(jìn)行了研究,為應(yīng)對(duì)流感大流行疫苗快速研發(fā)做好準(zhǔn)備。 一是針對(duì)高致病性人禽流感病毒H5N1高度變異的問題,開展了RG技術(shù)用于疫苗株的拯救。因?yàn)楦咧虏⌒匀饲萘鞲胁《綡5N1高度變異,需要不斷更換疫苗株,而快速、及時(shí)對(duì)流行株獲得大流行流感疫苗株將是有效控制流感爆發(fā)流行的首要環(huán)節(jié)之一。我們通過流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng),在BSL-3培養(yǎng)A/Anhui/1/2005 (H5N1)病毒,提取病毒RNA,利用基因重配技術(shù)將該病毒的HA(定點(diǎn)突變)、NA構(gòu)建到雙向表達(dá)質(zhì)粒pHW2000上,將構(gòu)建好的2質(zhì)粒和PR8 6質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞,獲得重組的PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒。運(yùn)用RT-PCR、血凝實(shí)驗(yàn)、電鏡、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)拯救的重組疫苗株病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,拯救PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒基因序列正確,血凝滴度達(dá)到1:320以上;電鏡下病毒形態(tài)正常,成絲狀和囊狀。CPE證實(shí)病毒毒力明顯降低,符合大流行流感疫苗株的要求,在國(guó)內(nèi)率先建立了反向遺傳學(xué)拯救流感疫苗株的關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)。 二是針對(duì)大流行流感疫苗生產(chǎn)原料來源的問題,開展了Vero細(xì)胞替代雞胚生產(chǎn)疫苗的研究。構(gòu)建了pCDNA3.1-ST3GalⅢ表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染、G418加壓篩選Vero細(xì)胞,獲得穩(wěn)定高效表達(dá)高致病性人禽流感病毒受體的Vero細(xì)胞株。運(yùn)用改造好的Vero細(xì)胞株培養(yǎng)PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒,通過細(xì)胞病變和血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒感染Vero細(xì)胞病毒復(fù)制滴度提高,TCID50達(dá)到106.5-7,較普通的Vero細(xì)胞提高了100-150倍,初步建立了Vero細(xì)胞生產(chǎn)大流行流感疫苗的細(xì)胞系。我們將Eng53/v-aNS基因置換了8質(zhì)粒系統(tǒng)的NS基因,重組病毒理論上可在Vero細(xì)胞上大量復(fù)制,但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻與預(yù)期值有差異,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。 三是噴鼻型大流行流感疫苗的研究,噴鼻大流行流感疫苗具有快速、簡(jiǎn)便大規(guī)模接種、免疫保護(hù)譜廣的特點(diǎn)。將大流行流感裂解疫苗分別使用不同的佐劑,采用不同的免疫途徑,分別檢測(cè)唾液、肺灌洗液中分泌型IgA,血液中的IgG、IgA,以及運(yùn)用HI實(shí)驗(yàn)來確定噴鼻疫苗最佳劑型和最佳免疫途徑。結(jié)果表明,蛋白體佐劑與VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1)制備的噴鼻型大流行流感裂解疫苗具用良好的免疫原性和安全性,其分泌型IgA是各類佐劑中最高的,其中肺灌洗液中IgA滴度為1:640,HI實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明,運(yùn)用蛋白體佐劑噴鼻免疫大流行流感裂解疫苗將是一個(gè)具有良好開發(fā)前景的舉措,。 結(jié)論:為加快適應(yīng)和滿足我國(guó)流感大流行疫苗研發(fā)和關(guān)鍵技術(shù)儲(chǔ)備能力的需求。我們?cè)趹?yīng)急上,已完成針對(duì)越南株大流行流感裂解原型疫苗的研究;圍繞疫苗研發(fā)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略上,針對(duì)高致病性人禽流感病毒H5N1株變異問題,建立了快速制備疫苗株的技術(shù)平臺(tái)、針對(duì)疫苗生產(chǎn)原料來源和質(zhì)量難以控制的特點(diǎn),初步建立了Vero細(xì)胞替代雞胚生產(chǎn)疫苗的技術(shù)平臺(tái)、針對(duì)注射疫苗不能產(chǎn)生局部免疫和交叉免疫保護(hù)的特點(diǎn),制備了噴鼻型大流行流感疫苗,可同時(shí)激發(fā)黏膜免疫和系統(tǒng)免疫,實(shí)現(xiàn)了對(duì)高致病性人禽流感病毒疫苗動(dòng)態(tài)互補(bǔ)的研發(fā)創(chuàng)新體系,為流感大流行做好了充分的準(zhǔn)備。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳稚峰,張立國(guó),董婕,吳昆昱,陳愛s，

本文編號(hào)：2470314