【摘要】： 目的 1、構(gòu)建及鑒定水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型,探討該模型在HBV疫苗評價中的應(yīng)用。 2、制備可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠,為人肝嵌合體小鼠模型的建立奠定基礎(chǔ)。 方法 1、復(fù)制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗評價中的應(yīng)用 (1) pAAV-HBV1.3質(zhì)粒的鑒定:含腺相關(guān)病毒倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列元件與包含1.3個拷貝HBV基因組(ayw亞型)的HBV表達(dá)質(zhì)粒pAAV-HBV1.3(由中國疾控中心病毒病所譚文杰教授惠贈),酶切鑒定并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7肝癌細(xì)胞系,ELISA方法檢測HBsAg、HBeAg的分泌表達(dá)水平。 (2)水動力法HBV小鼠模型的構(gòu)建:將pAAV-HBV1.3質(zhì)粒經(jīng)高壓水動力法尾靜脈注射C57BL/6小鼠,分別于注射后10天、30天、60天采集血液和肝組織標(biāo)本,ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg表達(dá);Real-Time PCR檢測血清及肝組織病毒載量;HE染色、免疫組化染色檢測肝組織病理學(xué)改變及病毒抗原在肝組織中的定位及表達(dá)。 (3)水動力法HBV小鼠模型的優(yōu)化:采用免疫抑制劑地塞米松注射液(DEX)腹腔注射小鼠,0.2ml/只/次(50mg/Kg)隔日一次連續(xù)3次,建立免疫功能抑制小鼠模型,在此基礎(chǔ)上制備乙肝病毒轉(zhuǎn)染小鼠模型,于注射后每周采集尾靜脈血,進(jìn)行血清HBsAg、HBeAg檢測及病毒載量檢測。 (4)水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型的鑒定:利用HBV商品化疫苗(商品名:安在時,成分:HBsAg)免疫小鼠,2μg/只,14天1次,共2次,生理鹽水為對照,200μl/只;第2次加強(qiáng)免疫14天后用水動力法轉(zhuǎn)染pAAV-HBV1.3,進(jìn)行免疫保護(hù)性實驗,在不同時間點采集尾靜脈血,ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR檢測血清病毒載量。 (5)水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型在疫苗評價中的應(yīng)用:用重組腺病毒(AdS)免疫C57BL/6小鼠,同時設(shè)置安在時疫苗(商品化疫苗)及生理鹽水為對照。分別于首次免疫前及每次免疫后10天采集尾靜脈血,ELISA檢測血清HBsAb,最后1次免疫14天后尾靜脈水動力法注射pAAV-HBV1.3質(zhì)粒溶液1.6m(l20μg/只),于不同時間點采集尾靜脈血,ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR檢測血清病毒載量。 2、可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 (1) pTet-on-Albumin轉(zhuǎn)基因小鼠的制備:構(gòu)建及鑒定含血清白蛋白增強(qiáng)子和啟動子序列的pTet-on-Albumin載體,在細(xì)胞水平驗證Albumin啟動子轉(zhuǎn)錄活性,通過將pTet-on-Albumin載體顯微注射B6/CBA雜合一代受精卵原核細(xì)胞的方法獲得轉(zhuǎn)基因首建鼠,然后與野生型C57BL/6雜交,PCR篩選轉(zhuǎn)基因陽性小鼠,RT-PCR、Western blot鑒定rtTA mRNA及蛋白表達(dá)。 (2) pTRE2-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備:構(gòu)建及鑒定含小鼠uPA基因的pTRE2- uPA載體,與pTet-on質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Huh7細(xì)胞系,細(xì)胞水平鑒定uPA的表達(dá)及其生物活性;通過將pTRE2-uPA載體顯微注射B6/CBA雜合一代受精卵原核細(xì)胞的方法獲得轉(zhuǎn)基因首建鼠,與野生型C57BL/6雜交,PCR篩選轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。 (3)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備:將已獲得穩(wěn)定的且在小鼠肝細(xì)胞特異性表達(dá)Albumin-rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠與TRE2-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,子代鼠Dox誘導(dǎo),誘導(dǎo)12周后處死小鼠,取血清和肝組織進(jìn)行ALT和肝組織uPA表達(dá)及病理學(xué)檢測,獲得可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠。 結(jié)果 1、復(fù)制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗評價中的應(yīng)用 (1) pAAV-HBV1.3質(zhì)粒的鑒定結(jié)果:將包含1.3倍全長HBV基因組的質(zhì)粒pAAV-HBV1.3酶切分析與預(yù)期結(jié)果相符,pAAV-HBV1.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞72h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA方法檢測HBsAg、HBeAg均為陽性,OD值分別為0.309及1.279,對照(未轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清)均為陰性。 (2)水動力法HBV小鼠模型的鑒定結(jié)果:C57BL/6小鼠尾靜脈水動力法注射pAAV-HBV1.3,10天時通過ELISA方法檢測小鼠血清HBsAg、HBeAg,結(jié)果均為陽性,感染率為100%;30天、60天時血清HBsAg、HBeAg ELISA檢測結(jié)果均為陰性。Real-Time PCR檢測小鼠血清及肝組織病毒載量,結(jié)果顯示,注射質(zhì)粒10天、30天及60天時實驗組小鼠血清及肝組織病毒載量明顯高于對照組,且在10天時達(dá)高峰,以后隨時間延長,血清及肝組織中病毒載量降低。免疫組化染色可見,10天時注射pAAV-HBV1.3小鼠肝組織均存在HBsAg、HBcAg陽性細(xì)胞,注射HBV質(zhì)粒30天和60天時小鼠肝組織未檢測到HBsAg、HBcAg陽性細(xì)胞。 (3)水動力法HBV小鼠模型的優(yōu)化結(jié)果:免疫系統(tǒng)功能抑制小鼠在轉(zhuǎn)染pAAV-HBV1.3質(zhì)粒后各組間HBsAg、HBeAg總體表達(dá)持續(xù)時間有顯著差異(P0.01,P0.05),且均為IP DEX 8周組表達(dá)最長,HBsAg和HBeAg在pAAV-HBV1.3轉(zhuǎn)染后第8周轉(zhuǎn)為陰性。結(jié)果顯示,通過抑制小鼠免疫狀態(tài),可明顯延長病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制和表達(dá)時間。 (4) HBV商品化疫苗對水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型鑒定結(jié)果:安在時疫苗免疫小鼠2次后即產(chǎn)生保護(hù)性抗體,pAAV-HBV1.3轉(zhuǎn)染后血清HBsAg、HBeAg均為陰性,生理鹽水組小鼠轉(zhuǎn)染pAAV-HBV1.3后血清HBsAg、HBeAg均為陽性。生理鹽水組小鼠轉(zhuǎn)染pAAV-HBV1.3后病毒載量明顯高于其他各組。實驗結(jié)果表明,高壓水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型可有效應(yīng)用于乙肝疫苗免疫效果的評價。 (5)水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型用于新型疫苗評價的實驗研究:第2次加強(qiáng)免疫后安在時疫苗組HBsAb均為陽性,AdS組及生理鹽水組均為陰性,安在時組與其它兩組間差異顯著(P0.01,P0.01),第4次加強(qiáng)免疫后AdS組HBsAb全部轉(zhuǎn)為陽性,生理鹽水組HBsAb為陰性,兩組間差異顯著(P0.01);pAAV- HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后安在時疫苗組HBsAg、HBeAg均為陰性,AdS組HBsAg、HBeAg持續(xù)時間明顯短于生理鹽水組,兩組在10天、12天時HBsAg陽性率有顯著差異(P0.01,P0.05),在15天時HBeAg陽性率有顯著差異(P0.05)。Real-Time PCR結(jié)果顯示AdS組與生理鹽水組病毒載量明顯高于安在時疫苗組(P0.05 ,P0.05),AdS組與生理鹽水組轉(zhuǎn)染后20天病毒載量差異顯著(P0.05)。實驗結(jié)果表明,構(gòu)建的表達(dá)HBV preS1-S-preS2的重組腺病毒候選疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用,但免疫效果明顯不如商品化疫苗。該實驗同時也表明,水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型在乙肝疫苗的免疫效果評價中有重要的應(yīng)用價值。 2、可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 (1) pTet-on-Albumin轉(zhuǎn)基因小鼠的制備:構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)肝組織特異性表達(dá)rt的調(diào)控質(zhì)粒pTet-on- Albumin,經(jīng)BamH I酶切可見4條帶(3026bp、2681bp、2000bp、1257bp),與pTRE2-EGFP共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,Dox誘導(dǎo)24h,結(jié)果表明未誘導(dǎo)組沒有綠色熒光表達(dá),而誘導(dǎo)組可見綠色熒光,細(xì)胞水平驗證Albumin啟動子具有轉(zhuǎn)錄活性。pTet-on- Albumin轉(zhuǎn)基因小鼠出生2周后提取基因組DNA,PCR陽性為轉(zhuǎn)基因首建鼠,與野生型C57BL/6小鼠交配,2周齡仔鼠剪尾提取基因組DNA,PCR檢測陽性為F1代小鼠,繁育獲得子代鼠,誘導(dǎo)后獲得子代鼠僅在肝組織檢測到rtTA mRNA及rtTA蛋白表達(dá)。 (2) pTRE2-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備:pTRE2-uPA質(zhì)粒經(jīng)SmaⅠ、HindⅢ雙酶切得4條帶(3549bp、1027bp、960bp和158bp),與pTet-on共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,Dox誘導(dǎo)36h后提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA,RT-PCR檢測uPA的表達(dá),誘導(dǎo)組細(xì)胞擴(kuò)增出1.3 kb的目地條帶;溶圈法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的uPA生物活性,除Dox誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)上清可觀察到溶圈現(xiàn)象,其他實驗組均未檢測到明顯的溶圈現(xiàn)象。pTRE2-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠分別在出生2周后提取基因組DNA,PCR陽性為轉(zhuǎn)基因首建鼠,與野生型C57BL/6小鼠交配,2周齡仔鼠剪尾提取基因組DNA,PCR檢測陽性為F1代小鼠。 (3)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備:pTet-on-Albumin F1代小鼠與pTRE2-uPA F1代小鼠交配,PCR鑒定陽性為可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠,病理切片HE染色可見Dox誘導(dǎo)后肝組織點狀壞死灶,免疫組化結(jié)果可見肝細(xì)胞中散在的uPA表達(dá)。血清ALT結(jié)果為雙轉(zhuǎn)基因小鼠Dox誘導(dǎo)后ALT顯著高于未誘導(dǎo)組(P0.01)。結(jié)果顯示,成功制備可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠,并經(jīng)過5代繁育,獲得pTet-on-Albumin-uPA雙轉(zhuǎn)基因純合子小鼠,目的基因表達(dá)穩(wěn)定。 結(jié)論 1、通過高壓水動力法建立了HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型;通過抑制小鼠免疫狀態(tài),可延長病毒在肝組織內(nèi)的復(fù)制與表達(dá)。 2、利用商品化疫苗進(jìn)行HBV小鼠模型的鑒定,實驗表明該模型可以有效應(yīng)用于疫苗評價;利用該模型對一種新型候選基因疫苗進(jìn)行了評價。 3、成功制備了可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并獲得穩(wěn)定傳代的純合子小鼠,為HBV感染人肝嵌合體小鼠模型的建立奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2465888