【摘要】： 目的 為了有效控制和預防結(jié)核病的流行和傳播,除了全面實施結(jié)核病控制專項外,我們還需要建立健全流行病學監(jiān)測體系,加強對結(jié)核分枝桿菌耐藥機制和耐藥結(jié)核病監(jiān)測的研究。為此,我們對近幾年福州地區(qū)分離的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行分子流行病學研究,以期了解本地區(qū)流行菌株的主要基因型及其分布情況,并評價基因分型的效果;從體內(nèi)和體外兩個層面對突變位點與耐藥的關(guān)系進行研究,以闡明katG基因新的突變引起異煙肼耐藥的機制;利用反向分子雜交方法檢測基因突變位點,為建立耐藥基因快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。 方法 1.運用Spoligotyping方法對福州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型,并與國際數(shù)據(jù)庫SpolDB4進行比較;同時對本地區(qū)北京基因型與非北京基因型在年齡、性別、耐藥株的分布情況進行比較分析; 2.運用MLVA-15方法對上述分離株進行基因分型,通過生物信息學軟件(Bionumerics5.0)對各基因型進行聚類分析,比較不同組別患者結(jié)核分枝桿菌成簇率的差別,探討結(jié)核分枝桿菌易于傳播的人群特征; 3.用HGDI指數(shù)比較兩種基因分型方法的效率; 4.選取菌株FJ05122(含新突變位點Asn329Val)、FJ05005(含常見突變位點Ser315Thr)和H37Rv(含野生型katG基因)分別作為實驗株、對照株和標準株,構(gòu)建單獨含上述突變位點和Arg463Leu位點、上述位點與Arg463Leu聯(lián)合突變位點、野生型katG基因的重組表達克隆和重組穿梭載體克隆; 5.以pProEx HTb質(zhì)粒構(gòu)建的各重組克隆表達重組KatG蛋白,純化后進行酶活性雙重染色以及過氧化氫酶、過氧化物酶活性測定,比較不同重組KatG蛋白酶活性的差異; 6.以pMV361質(zhì)粒構(gòu)建的各重組穿梭載體克隆電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌INH低耐藥株和高耐藥株,比較基因?qū)肭昂筠D(zhuǎn)化菌INH最小抑菌濃度MIC的改變; 7.對福州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rpoB、katG基因熱點突變區(qū)進行測序,了解福州地區(qū)耐藥基因突變的特點; 8.設(shè)計反向分子雜交探針,用于檢測耐藥菌株的基因突變位點,并與測序結(jié)果相比較,評價該檢測方法的敏感性和特異性。 結(jié)果 1. 245株菌中,有223株為已知的spoligotype,22株(21種)為SpolDB4未曾記錄的新基因型;福州地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌基因型主要為北京基因家族、H3基因家族、T1基因家族,分別占53.06%(130/245)、14.69%(36/245)、9.80%(24/245)。 2. Spoligotyping分型將245株結(jié)核分枝桿菌分為70種基因型,其中成簇基因型16個,獨特基因型54個,分辨率76.78%,菌株成簇率77.96%;最大一簇菌為北京基因型,北京基因型與非北京基因型在年齡、性別、耐藥株的分布均沒有顯著性差異。 3. MLVA分型將245株結(jié)核分枝桿菌分為163種基因型,其中成簇基因型27個,獨特基因型136個,分辨率98.28%,菌株成簇率44.49%;MLVA各位點多態(tài)性在0.040~0.661之間,其中ETR-E、MIRU26、MIRU10位點的多態(tài)性較好(h0.58), MIRU23位點的多態(tài)性較差(h0.10)。 4.兩種方法聯(lián)合使用時,116株北京基因型菌通過MLVA可以進一步分成65個基因型(14簇和51個獨特基因型),成簇基因型減少為24個,獨特基因型增加為182個,分辨率至98.65%,菌株成簇率35.51%。 5.與重組野生型KatG比較,Asn329Val突變可引起含該突變位點的重組KatG過氧化氫酶活性喪失,過氧化物酶活性降低約30%;Ser315Thr突變導致重組KatG過氧化氫酶活性下降約60%,過氧化物酶活性降低約30%。 6.含Asn329Val、Ser315Thr突變的katG基因進入恥垢分枝桿菌后,轉(zhuǎn)化菌的MIC較母本株增高,增加INH耐藥性;而野生型katG基因則使轉(zhuǎn)化菌的MIC較母本株降低,增加對INH敏感性。這種效果在INH低耐藥株和高耐藥株表現(xiàn)一致。 7.福州地區(qū)耐藥菌株中,rpoB基因突變主要發(fā)生在Ser531、His526、Asp516,發(fā)生率分別為51.72%、17.24%、8.05%;katG基因突變類型主要為Ser315Thr,發(fā)生率為46.91%。 8.利用反向雜交方法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥突變位點,在97株分離株(包含79株耐多藥菌株和18株全敏感株)檢測中,與測序結(jié)果比較, rpoB基因突變檢測的敏感性、特異性和一致性分別為87.69%、96.88%、90.22%;katGS315T突變檢測的敏感性、特異性和一致性分別為94.44%、90.16%、91.75%。 結(jié)論 1.北京基因型是福州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌主要的流行基因型,占53.06%;北京基因型與非北京基因型在年齡、性別、耐藥株分布情況均沒有顯著性差異;檢測出21種SpolDB4未有記錄的新的Spoligotypes; 2. Spoligotyping和MLVA是簡便可行的基因分型方法,可以用于流行病學監(jiān)測。Spoligotyping的效率低于MLVA,但Spoligotyping方法易于鑒別北京基因型;兩種方法聯(lián)合應用,可以提高基因分型的分辨率。 3. MLVA位點多態(tài)性差別較大,可以剔除多態(tài)性低的位點,增加多態(tài)性高的位點,以提高MLVA的分辨率。 4. katG基因Asn329Val突變,其重組蛋白過氧化氫酶活性喪失,是導致菌株耐藥的機制;該突變基因轉(zhuǎn)化進入恥垢分枝后,轉(zhuǎn)化菌MIC較母本株增加,進一步說明了該位點直接導致了菌株對異煙肼的耐藥性; 5.反向分子雜交方法可以快速、簡便地檢測耐多藥菌株的熱點耐藥突變。
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【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R378.911

【參考文獻】

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1 黃海榮,金奇,馬s，

本文編號：2458093