發(fā)布時間：2019-04-03 08:43

【摘要】： 內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的成份,其主要組成部分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。有研究顯示LPS能夠激活包括外周血單核細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分化成熟或產(chǎn)生各種內(nèi)源性的活性物質(zhì),如TNFs,IFNs,ILs和CSFs等�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌感染能觸發(fā)或抑制細(xì)胞凋亡,并且有結(jié)果顯示細(xì)菌引起的細(xì)胞凋亡中有腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL(TNF-relate apoptosis-inducing ligand TRAIL)的參與。TRAIL又稱為凋亡素2配體(APO-2L)。它屬于TNF超基因家族成員,正如該家族的其他成員一樣,TRAIL以Ⅱ型跨膜蛋白為主要表達(dá)方式。TRAIL能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡而對大多數(shù)正常細(xì)胞無影響。它通過與腫瘤細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,目前已發(fā)現(xiàn)TRAIL有5個受體,其中TRAIL受體1(死亡受體4 death receptor 4, DR4)和TRAIL受體2(死亡受體5 death receptor 5, DR5)胞內(nèi)段含有死亡結(jié)構(gòu)域,能夠傳遞凋亡信號,TRAIL通過與細(xì)胞膜上的DR4或DR5相互作用從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在生理條件下DR5與TRAIL的親和力明顯大于DR4,因此,在TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起主要作用的受體是DR5。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡,但內(nèi)毒素引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不完全清楚。內(nèi)毒素引起細(xì)胞凋亡與TRAIL的相關(guān)性如何鮮見報道。為探索TRAIL在內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的潛在作用,我們進(jìn)行本項目的研究。 目的:主要探討TRAIL的受體DR5在內(nèi)毒素引起肝細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制,并為進(jìn)一步研究內(nèi)毒素與其它細(xì)胞因子在肝細(xì)胞凋亡中的作用提供指導(dǎo),同時也為臨床上肝病治療研究提供新的思路。 方法:實驗分體外細(xì)胞學(xué)實驗和動物實驗兩部分。 第一部分:體外細(xì)胞學(xué)實驗,將人肝HL7702細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)貼壁后,分為對照組、內(nèi)毒素處理組、抗人DR5單抗mDRA-6處理組及聯(lián)合組(內(nèi)毒素+ mDRA-6)。在做不同處理后倒置顯微鏡下觀察L02細(xì)胞形態(tài)變化;MTT法檢測內(nèi)毒素對L02細(xì)胞生長的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測L02細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率;Annexin-V和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。 第二部分:動物實驗,選用6-8周齡的健康BALB/c小鼠,實驗分為三組:陰性對照組、單獨內(nèi)毒素處理組和DR5封閉TRAIL組。在做不同處理后檢測小鼠血清中ALT、AST和LDH含量變化;HE染色鏡下觀察肝細(xì)胞凋亡;Annexin-V和PI雙染法檢測肝細(xì)胞凋亡率;流式細(xì)胞術(shù)檢測肝細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率;免疫組化檢測肝細(xì)胞DR5的表達(dá)。 結(jié)果: 1.經(jīng)LPS處理的L02細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)特征,出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)邊緣化、凋亡小體形成。流式細(xì)胞術(shù)分析表明:對照組L02細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率為4.8%,用LPS (10 mg/L)處理12 h后,DR5表達(dá)率上調(diào)為37.76%。L02細(xì)胞12h凋亡率:LPS處理組、抗人DR5單抗mDRA-6處理組、LPS聯(lián)合mDRA-6組細(xì)胞凋亡率分別為37.78%(早期凋亡21.65%,晚期凋亡16.13%)、29.58%(早期凋亡18.21%,晚期凋亡11.37%)和65.81%(早期凋亡50.61%,晚期凋亡15.20%)(p0.05)。 2.經(jīng)LPS處理后小鼠血清中ALT、AST和LDH的含量隨著時間延長呈進(jìn)行性升高,在處理24h三種酶的含量達(dá)到最高峰,隨后開始下降。HE染色鏡下觀察單獨內(nèi)毒素處理組肝細(xì)胞凋亡較多,可見細(xì)胞體積縮小,胞質(zhì)致密深染,形成致密質(zhì)塊,并出現(xiàn)凋亡小體。DR5封閉TRAIL組細(xì)胞凋亡減少。流式檢測小鼠肝細(xì)胞凋亡率:單獨內(nèi)毒素處理組細(xì)胞凋亡率為45.02%(早期凋亡為13.59%,晚期凋亡為31.43%)。DR5封閉TRAIL組小鼠肝細(xì)胞凋亡率27.62%(早期凋亡為11.47%,晚期凋亡為16.15%);免疫組化染色觀察細(xì)胞DR5的表達(dá):單獨內(nèi)毒素處理組小鼠肝細(xì)胞DR5的表達(dá)率比對照組明顯增高。流式檢測對照組小鼠肝細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率是4.21%;單獨內(nèi)毒素處理組小鼠肝細(xì)胞DR5的表達(dá)率明顯增高為46.71%。 結(jié)論:1.內(nèi)毒素可以通過上調(diào)細(xì)胞表面DR5的表達(dá)誘導(dǎo)人肝細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡率與內(nèi)毒素的劑量及細(xì)胞表面DR5表達(dá)率呈相關(guān)性,內(nèi)毒素引起的人肝細(xì)胞凋亡是TRAIL的受體DR5起主要作用。 2.內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡,并且在內(nèi)毒素誘導(dǎo)下細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率明顯增高。sDR5可以和小鼠體內(nèi)的TRAIL相結(jié)合使肝細(xì)胞凋亡減少,內(nèi)毒素可以通過上調(diào)小鼠肝細(xì)胞表面DR5的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與TRAIL系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)。
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【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R363

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 郭建紅;多次小劑量LPS處理減輕慢性肝損傷的機(jī)制研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號：2453078