【摘要】： 內(nèi)向整流鉀離子通道(Inwardly Rectifying K Channel, Kir)是在各種組織中廣泛分布的一種鉀通道,因其電壓電流關(guān)系中所具有的內(nèi)向整流特性而得名。Kir2.0鉀通道的特征就是具有很強(qiáng)的內(nèi)向整流特性,這種整流作用有利于維持細(xì)胞的靜息電位使之接近鉀離子的平衡電位并參與動(dòng)作電位復(fù)極化過(guò)程。Kir2.3是Kir2.0家族中的重要一員,它具有內(nèi)向整流性鉀離子通道的普遍特征:(1)鉀離子向內(nèi)流較向外流容易。(2)內(nèi)向整流性鉀離子通道的功能均依賴于膜磷脂PIP2。(3)內(nèi)向整流性鉀離子通道可以被多種因素調(diào)節(jié),各種因素對(duì)不同的Kir通道調(diào)節(jié)情況不同。(4)Kir具有共有的基本結(jié)構(gòu),即:N末端起始于細(xì)胞內(nèi),經(jīng)兩次跨膜折疊后,C末端結(jié)束于細(xì)胞內(nèi)。 現(xiàn)已知蛋白激酶C(PKC)的激活可以對(duì)Kir通道的功能(如Kir2.3、Kir3.x和Kir6.x)產(chǎn)生抑制作用。PKC是依賴鈣、磷脂(phospholipid, PL)和二酰基甘油(diacylglycerol, DAG)激活的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶的多基因超家族,通過(guò)催化多種蛋白質(zhì)上Ser/Thr磷酸化,調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、增殖和分化。佛波醇-12-豆蔻酰-13-乙酸(PMA)是PKC的激活劑。PMA通過(guò)激活PKC而對(duì)內(nèi)向整流鉀離子通道產(chǎn)生抑制作用,但是對(duì)于不同的內(nèi)向整流鉀離子通道及其所表達(dá)細(xì)胞的不同,PMA產(chǎn)生的作用卻很不相同。PMA抑制Kir2.3通道但對(duì)Kir2.1通道沒(méi)有作用。Kir2.3通道表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞時(shí),對(duì)于PMA引起的抑制作用是非常敏感的,但Kir2.3通道表達(dá)在CHO細(xì)胞時(shí),應(yīng)用PMA卻看不到通道功能的抑制。雖然目前PMA通過(guò)激活PKC而對(duì)Kir2.3抑制的相關(guān)研究較多,但是有關(guān)PKC抑制Kir2.3的機(jī)制卻有很多疑點(diǎn),因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探討。 植物雌激素(genistein)是一種廣泛應(yīng)用的酪氨酸激酶抑制劑,在研究通道的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)通路時(shí)廣泛應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)genistein能夠抑制Kir2.3通道電流,因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)genistein抑制Kir2.3通道電流的機(jī)制也進(jìn)行了細(xì)致研究。 一、佛波醇酯通過(guò)激活蛋白激酶C抑制Kir2.3通道 目的:研究表達(dá)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的Kir2.3通道的電生理學(xué)特性,同時(shí)研究PKC激活劑PMA對(duì)Kir2.3通道功能的調(diào)節(jié)作用。 方法:(1)cRNA的體外轉(zhuǎn)錄:Kir2.3通道克隆在質(zhì)粒載體pGEMHE中。將質(zhì)粒線性化后,體外轉(zhuǎn)錄Kir2.3通道的cRNA。(2)爪蟾卵母細(xì)胞的分離與注射:在爪蟾冰凍麻醉狀態(tài)下,取出卵母細(xì)胞。在含2mg/ml膠原酶的OR2液中振蕩消化1.5-2小時(shí)。待細(xì)胞消化為單細(xì)胞后清洗細(xì)胞,進(jìn)行Kir2.3通道cRNA注射,注射后的細(xì)胞在含2.5 mM丙酮酸鈉的ND96中18℃培養(yǎng)。(3)雙電極電壓鉗(two-microelectrode voltage clamp,TEVC)方法檢測(cè)Kir2.3通道在卵母細(xì)胞中的表達(dá)情況和電流特性以及PMA對(duì)Kir2.3電流的影響。 結(jié)果:(1)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。質(zhì)粒電泳顯示兩條或兩條以上的泳帶;而線性化完全的質(zhì)粒DNA電泳顯示一條泳帶。體外轉(zhuǎn)錄RNA并進(jìn)行電泳分析,可得到一條清晰的RNA條帶,條帶均勻整齊無(wú)拖尾現(xiàn)象,經(jīng)RNA定量,RNA濃度為200 ng/μl。(2)Kir2.3通道電流特性。用TEVC方法檢測(cè)Kir電流。鉗制電壓為-90 mV逐漸變至+90 mV,灌流液為ND96K液,從Kir2.3電流的電壓電流曲線可以看出Kir通道的內(nèi)向電流較大且隨著電壓增加而增大,而外向電流很小且沒(méi)有明顯的電壓依賴性。Kir通道的內(nèi)向與外向電流轉(zhuǎn)換時(shí)的電流為零,此時(shí)的電位為反轉(zhuǎn)電位,反轉(zhuǎn)電位的位置與細(xì)胞外鉀離子濃度有關(guān),在ND96K溶液灌流的情況下,其反轉(zhuǎn)電位接近0 mV。用鉀通道的阻斷劑BaCl2可以阻斷Kir電流。(3)PMA抑制Kir2.3通道電流。在ND96K中加入100 nM PMA,能夠明顯抑制Kir2.3通道的電流,抑制率為46.3±5.2%。PMA的抑制作用起效較慢,在給藥后大約2到5分鐘開(kāi)始看到電流的減小,給藥后大約5到10分鐘電流的抑制作用到達(dá)穩(wěn)態(tài)并不再變化。PMA抑制Kir2.3通道的電流作用是不可逆的,在停用PMA并用對(duì)照液長(zhǎng)期沖洗的情況下,被抑制的Kir2.3通道電流無(wú)任何恢復(fù)。電流電壓關(guān)系曲線反映PMA沒(méi)有改變Kir2.3通道的內(nèi)向整流特性。PMA對(duì)Kir2.3通道電流的抑制具有濃度依賴性,采用Hill方程進(jìn)行擬合得到半數(shù)最大抑制濃度為17.7±0.13 nM。(4)PMA通過(guò)激活PKC抑制Kir2.3通道電流。PMA是公認(rèn)的PKC激活劑,因此PMA抑制Kir2.3通道電流很可能通過(guò)激活PKC。用PKC的另一個(gè)激活劑PDBu 100 nM,也能抑制Kir2.3通道電流,抑制率為40.8±3.4%。4α-PMA是PMA的無(wú)效結(jié)構(gòu)類(lèi)似物,100 nM 4α-PMA對(duì)Kir2.3通道電流無(wú)作用,抑制率為0.6±0.0%。用PKC的特異性抑制劑Bisindolylmalimide(5μM)預(yù)處理卵母細(xì)胞2小時(shí),并在Bisindolylmalimide持續(xù)存在的情況下再給予PMA明顯降低了PMA對(duì)Kir2.3通道電流的抑制程度,抑制率為11.8±2.0%。上述結(jié)果說(shuō)明PMA是通過(guò)激活PKC途徑對(duì)Kir2.3通道電流產(chǎn)生抑制作用的。 結(jié)論:以爪蟾卵母細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng),將體外轉(zhuǎn)錄得來(lái)的RNA以微注射方式注入卵母細(xì)胞可表達(dá)Kir2.3通道。用雙電極電壓鉗方法可觀察卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Kir通道的電生理特性。Kir2.3通道電流具有內(nèi)向整流特性,Ba2+可通過(guò)與Kir通道的孔區(qū)結(jié)合而阻斷Kir通道鉀電流。PMA作為PKC的激活劑可以濃度依賴性抑制Kir2.3通道電流。PKC的抑制劑可以阻斷PMA的抑制作用。 二、PKC抑制Kir2.3通道的機(jī)制研究 目的:PMA通過(guò)激活PKC抑制Kir2.3通道,但對(duì)其具體機(jī)制還有很多爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合利用分子生物學(xué)和電生理學(xué)方法,對(duì)其機(jī)制進(jìn)行細(xì)致探討。 方法:(1)分子生物學(xué)方法:Kir2.3,Kir2.1和一些突變體通道均克隆于在質(zhì)粒載體pGEMHE中,轉(zhuǎn)錄為cRNA并純化后注射入卵母細(xì)胞。嵌合體通道采用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)構(gòu)建。點(diǎn)突變采用美國(guó)stratagene公司的site-directed mutagenesis kit。所有的序列均經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證。(2)細(xì)胞膜蛋白的提取與免疫印跡:將表達(dá)通道的卵母細(xì)胞勻漿后,4℃,5000 g,離心5min。取上清,4℃,20萬(wàn)g,離心1h,棄上清,用裂解緩沖液重懸沉淀(1μl/細(xì)胞)。將提取的膜蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉后,用特異性一抗和熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè),顯色用Odyssey9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描。(3)細(xì)胞表面膜蛋白的提取:應(yīng)用生物素標(biāo)記法提取細(xì)胞表面膜蛋白,表達(dá)通道的卵母細(xì)胞在PMA處理后,用甲醛固定,NHS-SS-biotin生物素孵育過(guò)夜,勻漿后加入Neutravidin-linked beads,洗滌珠子,進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。(4)免疫共沉淀:將提取的膜蛋白加入特異性一抗過(guò)夜,加入protein-G beads,洗滌珠子,進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。(5)免疫細(xì)胞化學(xué):表達(dá)通道的卵母細(xì)胞用甲醛固定后,用PBS配制含3%BSA和0.2% tritonX-100的封閉液進(jìn)行封閉,加入特異性一抗和熒光標(biāo)記的二抗,用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)本顯色情況。(6)放射自顯影:表達(dá)通道的卵母細(xì)胞用同位素32P正磷酸鹽孵育過(guò)夜,提取膜蛋白,免疫共沉淀,SDS-PAGE并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,壓膠片,進(jìn)行放射自顯影。(7)電生理學(xué)方法:按前述方法用雙電極電壓鉗記錄電流。 結(jié)果:(1)PKC抑制Kir2.3通道電流與PIP2有關(guān)。PMA可以抑制表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞的Kir2.3通道電流,抑制率為46.3±5.2%,對(duì)Kir2.1通道電流沒(méi)有作用;PMA對(duì)Kir2.3(I213L)的抑制減弱,抑制率為16.9±3.1%,而PMA對(duì)Kir2.1(L222I)的抑制作用增強(qiáng),抑制率為8.9±1.7%。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Kir2.3通道與PIP2親和力要弱于Kir2.1通道與PIP2親和力,而Kir2.3(I213L)明顯的增強(qiáng)了Kir2.3通道與PIP2的親和力,Kir2.1(L222I)則明顯減弱了Kir2.1通道與PIP2的親和力。結(jié)合這些結(jié)果,我們的上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PKC抑制Kir2.3通道電流和通道與PIP2親和力有關(guān)。(2)PKC抑制Kir2.3通道電流和通道第53位與213位氨基酸有關(guān)。Kir2.3和Kir2.1通道屬于同一個(gè)Kir2.0亞家族,他們的氨基酸序列具有58%的同源性,構(gòu)建Kir2.3和Kir2.1通道的嵌合體極有可能產(chǎn)生功能性通道。Kir通道的結(jié)構(gòu)有兩個(gè)跨膜區(qū)(M1,M2)和位于胞內(nèi)的一個(gè)較短的氨基末端(N)和一個(gè)較長(zhǎng)的羧基末端(C)。構(gòu)建Kir2.3和Kir2.1通道的嵌合體,通道命名原則如下:數(shù)字1和3分別代表Kir2.1和Kir2.3通道,字母N代表氨基末端,字母C代表羧基末端,字母P代表兩個(gè)跨膜區(qū)和孔區(qū)。將嵌合體通道表達(dá)于卵母細(xì)胞,給予100 nM PMA,發(fā)現(xiàn)PMA抑制N3P1C3,抑制率為42.8±3.8%,對(duì)N1P3C1無(wú)作用,這表明Kir2.3通道的氨基末端和羧基末端在PKC對(duì)Kir2.3通道的抑制中起決定作用。PMA抑制N1P3C3,抑制率為12.1±2.0%;PMA抑制N3P1C1,抑制率為33.6±2.5%;PMA可以抑制N3P3C1,抑制率為25.3±4.1%;PMA也抑制N1P1C3,抑制率為13.9±2.7%。這些結(jié)果表明Kir2.3通道的氨基末端和羧基末端都在PKC對(duì)Kir2.3通道的抑制中起決定作用,二者缺一不可。為了進(jìn)一步找到PKC的作用位點(diǎn),我們構(gòu)建了兩個(gè)突變體:Kir2.3(T53I)和Kir2.1(I79T)。結(jié)果表明PMA抑制Kir2.3(T53I),抑制率為36.3±3.1%,與PMA對(duì)Kir2.3的抑制有顯著性差異(p0.05),PMA不能抑制Kir2.1(I79T)。我們?cè)谏鲜鼋Y(jié)果已經(jīng)表明Kir2.3第213位異亮氨酸在PKC對(duì)Kir2.3通道的作用中很重要,因此我們又進(jìn)一步構(gòu)建了兩個(gè)雙突變通道:Kir2.3(T53I,I213L)和Kir2.1(I79T,L222I)。給予100 nM PMA,發(fā)現(xiàn)PMA不能抑制Kir2.3(T53I,I213L),抑制率僅為4.2±9.3%,同PMA對(duì)Kir2.1的抑制無(wú)差異(p0.05);PMA可以抑制Kir2.1(I79T,L222I),抑制率為13.8±1.5%,與PMA對(duì)Kir2.1的抑制有顯著性差異(p0.05)。這個(gè)結(jié)果表明Kir2.3通道第53位蘇氨酸與第213位異亮氨酸是PKC的作用位點(diǎn)。(3)Kir2.3通道第53位與213位氨基酸也是決定通道被其他因素調(diào)節(jié)的關(guān)鍵位點(diǎn)。我們前期結(jié)果表明:a:疊氮化鈉(Azide)和碳酸氫鉀(KHCO3)都能使細(xì)胞內(nèi)pH降低,由此抑制Kir2.3通道電流,而對(duì)Kir2.1通道電流沒(méi)有作用;b:渥漫青霉素(Wortmannin)(PI-4K(磷脂酰肌醇-4激酶)抑制劑,通過(guò)抑制PI-4K而阻斷PIP2合成)可抑制功能依賴PIP2的鉀通道功能,抑制程度與通道和PIP2親和力負(fù)相關(guān)。我們進(jìn)一步觀察了上述因素對(duì)Kir2.3和Kir2.1及突變體功能的影響,并與PMA對(duì)通道功能的影響結(jié)果進(jìn)行比較。灌流Azide(3 mM)或KHCO3-ND96K 2min,或10μM Wortmannin孵育表達(dá)不同通道的卵母細(xì)胞2小時(shí)后,記錄電流大小,同未孵育的表達(dá)相同通道的卵母細(xì)胞電流大小進(jìn)行比較。結(jié)果表明Azide和KHCO3及Wortmannin等調(diào)控因子對(duì)Kir2.3及這些突變體的作用與PMA的作用相一致。即:與Kir2.3相比,Kir2.3(T53I)、Kir2.3(I213L)和Kir2.3(T53I,I213L),都對(duì)這些調(diào)控因子的反應(yīng)減弱,且減弱的程度以Kir2.3(T53I,I213L)為最大;而與Kir2.1相比,Kir2.1(I79T)、Kir2.1(L222I)、Kir2.1(I79T,L222I)都增強(qiáng)了對(duì)這些調(diào)控因子的反應(yīng),且增強(qiáng)的程度以Kir2.1(I79T,L222I)為最大。結(jié)合以上(2)、(3)兩方面的結(jié)果,我們認(rèn)為與其他因素一樣,PMA很可能是通過(guò)影響通道與PIP2的相互作用而影響Kir2.3功能。(4)PKC抑制Kir2.3通道電流與通道蛋白磷酸化無(wú)關(guān)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Kir2.3通道的氨基末端在PKC對(duì)Kir2.3的抑制作用中相對(duì)更重要,在通道氨基末端只有兩個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn):S36和S39,我們把它們同時(shí)突變?yōu)闉楦拾彼岷蟀l(fā)現(xiàn)Kir2.3 (S36G,S39G)仍然能被PMA抑制,抑制率為56.0±2.6%,與Kir2.3相比無(wú)差異。Okadaic acid (OA)是蛋白磷酸酶的抑制劑,若PKC使Kir2.3通道蛋白磷酸化從而抑制通道電流,那么蛋白磷酸酶活性的抑制則應(yīng)該使PKC抑制Kir2.3通道電流程度增加。然而,向卵母細(xì)胞注射20 nM OA沒(méi)有改變PMA對(duì)Kir2.3的抑制,抑制率為42.2±1.7%。我們又直接觀察了Kir2.3通道蛋白的磷酸化情況。用32P孵育卵母細(xì)胞后,提取卵母細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行放射自顯影。結(jié)果顯示在Kir2.3通道蛋白量一致的情況下,PMA處理前后Kir2.3通道蛋白放射自顯影的量化分析無(wú)差異(p0.05)。我們同時(shí)以PKC本身作為磷酸化反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照,PMA處理后PKC放射自顯影程度明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明PMA可以激活并磷酸化PKC,但PKC沒(méi)有使Kir2.3通道蛋白磷酸化,也就是說(shuō)PKC抑制Kir2.3通道電流與通道蛋白磷酸化無(wú)關(guān)。(5)PKC抑制Kir2.3通道電流可能與通道蛋白轉(zhuǎn)位有關(guān)。Phalloidin能夠牢固地結(jié)合于細(xì)胞的F actin,使之不能解聚,從而使肌動(dòng)蛋白變得非常僵硬;Latrunculin A能夠破壞肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),抑制微絲蛋白調(diào)控的過(guò)程。Phalloidin和Latrunculin A因而能影響蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。結(jié)果表明Phalloidin 10μM注射卵母細(xì)胞2小時(shí)后,降低了PMA抑制Kir2.3電流的作用,PMA的抑制率降為7.5±1.6%;Latrunculin A 1μM預(yù)孵育卵母細(xì)胞2小時(shí)后,PMA對(duì)Kir2.3通道電流抑制作用也降低,抑制率為31.3±3.3%。上述結(jié)果提示PKC抑制Kir2.3通道電流可能與通道蛋白轉(zhuǎn)位有關(guān)。采取細(xì)胞免疫化學(xué)的方法,結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞膜Kir2.3進(jìn)行了定量分析,發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞膜Kir2.1在PMA處理前后熒光強(qiáng)度量化分析無(wú)差異(p0.05);而卵母細(xì)胞膜Kir2.3在PMA處理后熒光強(qiáng)度下降到51.1±8.9%,同對(duì)照相比有顯著性差異(p0.05)。這說(shuō)明在PMA作用后細(xì)胞膜上Kir2.3通道蛋白數(shù)量減少,通道極有可能進(jìn)行了內(nèi)吞。最后我們采用生物素法特異性提取細(xì)胞跨膜蛋白,結(jié)果顯示PMA作用后細(xì)胞膜上Kir2.3通道蛋白數(shù)量少于PMA作用前,免疫印跡結(jié)果表明條帶灰度下降到61.2±10.4%。這也進(jìn)一步提示PKC抑制Kir2.3通道電流可能與通道蛋白轉(zhuǎn)位有關(guān)。 結(jié)論:PKC抑制Kir2.3通道電流可能與通道和PIP2親和力有關(guān), Kir2.3通道的第53位與213位氨基酸是影響Kir2.3通道被包括PMA在內(nèi)的多種調(diào)節(jié)因素調(diào)節(jié)的關(guān)鍵位點(diǎn)。PKC抑制Kir2.3通道電流與通道蛋白磷酸化無(wú)關(guān)。PKC抑制Kir2.3通道電流可能與通道蛋白轉(zhuǎn)位有關(guān)。Kir2.0家族鉀離子通道與膜PIP2反應(yīng)特征可能也決定其在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜間的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。 三、植物雌激素抑制Kir2.3通道電流的分子機(jī)制研究 目的:觀察酪氨酸激酶抑制劑植物雌激素genistein對(duì)表達(dá)在卵母細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中的Kir2.3和Kir2.1通道的作用,并進(jìn)一步研究genistein的作用機(jī)制。 方法:(1)分子生物學(xué)方法:Kir2.3,Kir2.1和一些突變體通道按前述方法表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞。(2)細(xì)胞膜蛋白的提取與免疫印跡和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)如前述。(3)電生理學(xué)方法:按前述方法用雙電極電壓鉗記錄電流。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法在HEK293細(xì)胞表達(dá)Kir2.3和Kir2.1通道,用全細(xì)胞膜片鉗記錄通道電流。 結(jié)果:(1)Genistein特異性抑制Kir2.3電流。Genistein特異性抑制Kir2.3電流,100μM genistein對(duì)Kir2.3抑制率為44.8±2.1%。對(duì)Kir2.1和Kir3.4*(Kir3.4-S143T)沒(méi)有作用。在卵母細(xì)胞,Genistein濃度依賴性抑制Kir2.3電流,半數(shù)最大抑制濃度為16.9±2.8μM;在HEK293細(xì)胞,半數(shù)最大抑制濃度為19.3±3.2μM。在卵母細(xì)胞,Genistein起效很快,在90.7±4.2秒就可到達(dá)平臺(tái)期,并且抑制作用易于被洗脫。Genistein的這種抑制作用沒(méi)有電壓依賴性。(2)Genistein對(duì)Kir2.3的抑制作用不是通過(guò)改變通道的酪氨酸磷酸化狀態(tài)起作用。Daidzein是genistein的無(wú)效結(jié)構(gòu)類(lèi)似物;tyrphostin 23是Genistein的功能類(lèi)似物,但與genistein結(jié)構(gòu)不同,他們都不能夠抑制Kir2.3電流。Vanadate,酪氨酸磷酸酶的抑制劑,也沒(méi)有改變genistein對(duì)Kir2.3電流的抑制作用。應(yīng)用抗酪氨酸磷酸化抗體PY99進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明genistein沒(méi)有改變通道的酪氨酸磷酸化狀態(tài)。這些結(jié)果都說(shuō)明genistein不是通過(guò)抑制酪氨酸激酶而抑制Kir2.3電流。(3)Genistein對(duì)Kir2.3的抑制作用不是通過(guò)改變通道與PIP2的親和力起作用。Kir2.3(I213L)明顯地增強(qiáng)了Kir2.3通道與PIP2的親和力,但genistein對(duì)其抑制作用同Kir2.3相比沒(méi)有明顯差異(p0.05),100μM genistein對(duì)Kir2.3(I213L)抑制率為47.5±2.6%。Kir3.4與PIP2有較弱的親和力,但genistein對(duì)其沒(méi)有作用。(4)Kir2.3通道的跨膜區(qū)和孔區(qū)在genistein抑制作用中起重要作用。構(gòu)建Kir2.3與Kir2.1的嵌合體通道,表達(dá)于卵母細(xì)胞,灌流genistein,發(fā)現(xiàn)通道的跨膜區(qū)和孔區(qū)在genistein抑制作用中起重要作用,二者缺一不可。 結(jié)論:植物雌激素(genistein)特異性抑制Kir2.3通道電流,這種抑制作用沒(méi)有改變通道的酪氨酸磷酸化狀態(tài),通道的跨膜區(qū)和孔區(qū)在genistein抑制作用中起重要作用。本研究對(duì)于研究Kir2.3通道的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系和研發(fā)Kir2.3通道特異性的調(diào)節(jié)劑有重要意義。 總結(jié) 1用雙電極電壓鉗方法可觀察卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Kir通道的電生理特性。Kir2.3通道電流具有內(nèi)向整流特性,Ba2+可阻斷Kir通道的鉀電流。PMA可以濃度依賴性抑制Kir2.3通道電流。PKC的抑制劑可以阻斷PMA的抑制作用。PMA是通過(guò)激活PKC而抑制Kir2.3通道電流的。 2 PKC抑制Kir2.3通道電流與通道和PIP2親和力有關(guān),Kir2.3通道的第53位與213位氨基酸是影響Kir2.3通道被包括PMA在內(nèi)的多種調(diào)節(jié)因素調(diào)節(jié)的關(guān)鍵位點(diǎn)。PKC抑制Kir2.3通道電流與通道蛋白磷酸化無(wú)關(guān)。PKC抑制Kir2.3通道電流可能與通道蛋白轉(zhuǎn)位有關(guān)。Kir2家族鉀離子通道與膜PIP2反應(yīng)特征可能也決定其在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜間的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。 3植物雌激素genistein特異性抑制Kir2.3通道電流,這種抑制作用沒(méi)有改變通道的酪氨酸磷酸化狀態(tài),通道的跨膜區(qū)和孔區(qū)在genistein抑制作用中起重要作用。本研究對(duì)于研究Kir2.3通道的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系和研發(fā)Kir2.3通道特異性的調(diào)節(jié)劑有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R33

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐尚志;蛋白激酶C族[J];藥學(xué)進(jìn)展;1994年01期

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本文編號(hào)：2453164