【摘要】： 一、研究背景和目的 腸出血型大腸埃希菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7是一種新型腸道致病菌,能引起人出血性腸炎(hemorrhagic colitis,HC)、溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(thromboticthromobocytopenie porpura,TTP)等。 EHEC O157:H7感染呈暴發(fā)流行趨勢(shì),具有高度的致病性與致死性,已成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前,尚缺乏有效的防治方法,使用抗生素治療可促使大腸埃希菌O157:H7釋放致死性志賀毒素(Shiga toxin,Stx),加劇患者并發(fā)HUS的危險(xiǎn)性�？梢�(jiàn),研制出安全、有效的疫苗對(duì)預(yù)防EHEC O157:H7感染具有重要意義。迄今為止,尚無(wú)成功的疫苗用于臨床。 EHEC O157:H7的毒力因子主要有轉(zhuǎn)位緊密黏附素受體(translocationimimin receptor,Tir)、緊密黏附素(Intimin)、志賀毒素1型、2型(StX 1、Stx 2)和溶血素(Haemolysin,Hly)等。轉(zhuǎn)位緊密黏附素受體(Tir)經(jīng)細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)位進(jìn)入宿主細(xì)胞并定位于細(xì)胞膜上,與緊密黏附素結(jié)合后,可引起宿主細(xì)胞多聚肌動(dòng)蛋白聚合,造成黏附局部微絨毛刷狀緣破壞,形成特征性的黏附和抹平損傷(attaching and effacing lesion,A/E lesion)。因此,阻斷緊密黏附素與Tir的結(jié)合,可避免黏附和擦拭性損傷的發(fā)生,在感染的黏附階段予以拮抗。 本研究從NCBI網(wǎng)站GenBank上查到EHEC O157:H7標(biāo)準(zhǔn)株EDL933轉(zhuǎn)位緊密黏附素受體完整的編碼區(qū)(cds)基因序列(Accession number NC 002655.2)和氨基酸序列(protein id NP290261.1)。利用生物信息學(xué)在線工具和軟件,預(yù)測(cè)分析其蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性,判斷能否作為疫苗候選抗原;設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增Tir編碼基因;將PCR產(chǎn)物克隆到pET-30a(+)載體上,獲得重組原核表達(dá)質(zhì)粒[pET-30a(+)-tir];轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21/DE3,誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組蛋白Tir;將重組蛋白Tir免疫小鼠,檢測(cè)血清和糞便提取物中抗體效價(jià),對(duì)重組蛋白Tir的動(dòng)物免疫保護(hù)作用進(jìn)行了初步研究。 二、研究方法 1-EHEC O157:H7 Tir基因的生物信息學(xué)分析 從NCBI網(wǎng)站GenBank上查到EHEC O157:H7標(biāo)準(zhǔn)株EDL933 Tir完整的編碼區(qū)基因序列和氨基酸序列。運(yùn)用在線網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器蛋白分析專(zhuān)家系統(tǒng)Expasy(http://ca.expasy.org/)所提供的蛋白組學(xué)和序列分析工具,預(yù)測(cè)Tir的理化性質(zhì),如分子量、等電點(diǎn)、一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)等;利用服務(wù)器http://www.cbs.dtu.dk,使用Phobius工具預(yù)測(cè)Tir的跨膜螺旋所在區(qū)域;使用B細(xì)胞表位在線分析軟件(http://tools.immuneepitope.org.tools)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位。 2.EHEC O157:H7 Tir基因的克隆、表達(dá)和鑒定 2.1 Tit基因的擴(kuò)增和克隆 根據(jù)目的基因的ORF和原核表達(dá)質(zhì)粒PET-30a(+)酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)2條引物,PCR擴(kuò)增tir基因,限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和空質(zhì)粒PET-30a(+),T4連接酶連接。用PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。 2.2 Tir基因的表達(dá)、純化和鑒定 將重組質(zhì)粒PET-30a(+)-tir轉(zhuǎn)化至BL21/DE3中,在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白Tir,用12%SDS-PAGE鑒定,用親和層析純化蛋白。抗6×His單克隆抗體稀釋液為一抗,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG稀釋液為二抗,通過(guò)Western Blotting方法,鑒定重組蛋白的免疫反應(yīng)性。 2.3動(dòng)物免疫和EHEC O157:H7 Tir基因的抗體效價(jià)測(cè)定 重組蛋白Tir與弗氏完全佐劑(第二、三次用弗氏不完全佐劑)或霍亂毒素B亞單位(Cholera toxin B subunit,CTB)混合后,通過(guò)皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠,對(duì)照組用PBS免疫,每間隔2周加強(qiáng)免疫一次。免疫前及免疫3次后10d每組隨機(jī)抽10只小鼠,從小鼠眼眶采集血清和收集糞便,間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)和糞便提取物中抗體效價(jià)。 3.小鼠攻毒實(shí)驗(yàn) 末次免疫20 d后,以EHEC O157:H7活菌進(jìn)行動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn),小鼠于攻毒前禁食、禁水12h,每只小鼠經(jīng)食道灌注1×10~(10)CFU/ml EHEC O157:H7活菌0.3ml,同時(shí)腹腔注射絲裂霉素(2.5 mg/ml)。攻毒后12h恢復(fù)飲食飲水,并記錄動(dòng)物死亡情況。15d后,存活的小鼠處死剖檢,病理切片觀察。 三、結(jié)果 1-EHEC O157:H7 Tir基因的生物信息學(xué)分析 tir基因全長(zhǎng)1,677bp,起始密碼子為ATG,終止密碼子為T(mén)AA,編碼558個(gè)氨基酸。理論相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別是58022.4Da和5.01。在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定,蛋白質(zhì)總體親水性高。InterProScan分析該氨基酸序列含有三個(gè)結(jié)構(gòu)和功能域,即Tir的N端、C端和與Intimin結(jié)合的M區(qū)。Sec(secondary structure)預(yù)測(cè)α螺旋(H)、β折疊(E)和無(wú)規(guī)卷曲(L)的比例分別是22.76:17.38:59.86,二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲為主。Phobius預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Tir蛋白有2段跨膜結(jié)構(gòu),2個(gè)肽段在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),1個(gè)肽段在細(xì)胞膜外。Bepipred分析預(yù)測(cè)有20個(gè)B細(xì)胞線性表位肽段。 2.EHEC O157:H7 Tir基因的克隆、表達(dá)和鑒定 用設(shè)計(jì)合成的引物擴(kuò)增出tir基因,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示,大小為1,677bp,與預(yù)期一致。重組質(zhì)粒pET-30a(+).咖經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定,證實(shí)構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示與理論預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量相符,親和層析純化后獲得目的蛋白Tir。 Western Blotting鑒定結(jié)果顯示,空載體pET-30a(+)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物不與抗6×His單克隆抗體反應(yīng),而純化的融合蛋白和pET-30a(+)-tir重組菌株IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物在60kD左右處均出現(xiàn)1條特異條帶,證明目的蛋白融合了6×His標(biāo)簽,大小與預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量相符。 3.EHEC O157:H7 Tir抗體效價(jià)測(cè)定 皮下免疫和鼻腔免疫后,小鼠血清中均能檢測(cè)到高滴度的IgG類(lèi)抗體;皮下免疫組的血清滴度達(dá)到6400,鼻腔免疫組為3200;鼻腔免疫組血清獲得的IgA類(lèi)抗體滴度為6400,明顯高于皮下免疫組(200)。鼻腔免疫組糞便提取物sIgA類(lèi)抗體滴度為16,也高于皮下免疫組(4)。 4.動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)在15d觀察期內(nèi),皮下對(duì)照組和鼻腔對(duì)照組死亡7只,存活7只,存活率為50%。皮下免疫組死亡5只,存活9只,存活率為64.3%(9/14)。鼻腔免疫組死亡1只,存活13只,存活率為92.9%(13/14)。 經(jīng)x~2檢驗(yàn)分析,鼻腔免疫組與其對(duì)照組有顯著性差異(P=0.033);皮下免疫組與其對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.704)。 四、結(jié)論 擴(kuò)增的tir基因大小為1,677bp,為完整的編碼區(qū)基因序列,編碼蛋白Tir相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別是58022.4Da和5.01,在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定,蛋白質(zhì)總體親水性較高,含有2段跨膜結(jié)構(gòu)和3個(gè)功能域。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Tir毒力因子是很有潛力的疫苗候選抗原。 成功構(gòu)建了pET-30a(+)-tir原核表達(dá)載體,細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出重組融合蛋白,純化得到重組融合蛋白,分子量大小為60KD左右。 重組蛋白通過(guò)皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠后,均可刺激小鼠產(chǎn)生特異性IgG和IgA類(lèi)抗體,在糞便提取物中也能檢測(cè)到IgA類(lèi)抗體。皮下免疫組的血清IgG類(lèi)抗體滴度高于鼻腔免疫組;鼻腔免疫組獲得的IgA類(lèi)抗體滴度明顯高于皮下免疫組;鼻腔免疫組糞便提取物IgA類(lèi)抗體滴度亦高于皮下免疫組。 對(duì)小鼠進(jìn)行半數(shù)致死量EHEC O157:H7活菌攻毒后,皮下免疫組產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用小,鼻腔免疫組可產(chǎn)生顯著的免疫保護(hù)作用。 綜上所述,Tir是具有良好應(yīng)用前景的EHEC O157:H7疫苗的候選抗原。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R516;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2435888