【摘要】： 研究背景與目的 異基因造血干細(xì)胞移植(Allo—HSCT)是治療惡性血液病的有效手段,但是,對于高度危險(xiǎn)型白血病,Allo—HSCT后復(fù)發(fā)率仍然高達(dá)81%。如何提升GVL效應(yīng),降低移植后復(fù)發(fā)率是提升高度危險(xiǎn)型白血病治療效果的關(guān)鍵所在。 Allo—HSCT中,同種異體反應(yīng)性自然殺傷(Allo-reactive Natural Killer,Allo-NK)細(xì)胞因具有對惡性細(xì)胞殺傷的高效性和對受者正常細(xì)胞的低損傷性,是GVL效應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞。 NK細(xì)胞的效應(yīng)發(fā)揮受HLA-KIR等抑制性信號(hào)和NKG2DL-NKG2D等活化性信號(hào)共同調(diào)節(jié),二者對沖后的優(yōu)勢信號(hào)決定NK細(xì)胞的功能狀態(tài)。單倍體相合移植中,HLA單倍體相合供者NK細(xì)胞表面的KIR和與受者靶細(xì)胞表面的HLA分子結(jié)合,可傳遞殺傷抑制信號(hào),抑制了NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷。針對這一靶點(diǎn),本研究采用封閉供者NK細(xì)胞抑制性KIR表達(dá)的方法,人工誘導(dǎo)KIR錯(cuò)配,減少對NK細(xì)胞殺傷活性的抑制,以其提升NK細(xì)胞抗白血病效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)方法 第一部分Ly49—H-2信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)的體外研究 以Balb/C(H—2~d)×C57BL/6(H—2~b)雜交F1代(H—2~(d/b))小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞作為NK細(xì)胞來源,MACS陽選得DX5~+NK細(xì)胞。流式細(xì)胞儀(Flow cytometry,FCM)檢測NK細(xì)胞純度和編輯前、后NK細(xì)胞表面Ly49表達(dá)。常規(guī)培養(yǎng)NK細(xì)胞敏感靶細(xì)胞YAC-1,LDH釋放法用于檢測NK細(xì)胞對其殺傷活性。以C57BL/6鼠源性紅白血病細(xì)胞株FBL-3為靶,LDH釋放法檢測未處理NK細(xì)胞組(編輯前NK細(xì)胞組)、抗體阻斷NK細(xì)胞組(14811單抗與NK細(xì)胞共孵育)、編輯后NK細(xì)胞組(效靶細(xì)胞10:1共孵育24h)和抗體阻斷編輯后NK細(xì)胞組對其殺傷活性。 第二部分RNAi-Ly49對NK細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)的影響 F1代鼠NK細(xì)胞分離純化同第一章,編號(hào)為124,335,589,91的四條siRNAoligo轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞,FCM檢測干擾后各組NK細(xì)胞Ly49C表達(dá)以篩選有效siRNAoligo。選取最高抑制組NK細(xì)胞,LDH釋放法檢測其對YAC-1和FBL-3細(xì)胞殺傷活性。 第三部分RNAi-Ly49對單倍體相合移植模型中NK細(xì)胞GVL效應(yīng)的影響 雌性荷白血病C57BL/6鼠為受者,雄性CB6F1小鼠為供者,進(jìn)行骨髓移植。受鼠隨機(jī)分為5組,每組10只。移植組在9Gy照射后行F1到C57移植構(gòu)建單倍體相合小鼠移植模型,觀察GVL效應(yīng)。 A組,未處理白血病組 B組,單純照射組 C組,照射后單純移植組,輸注骨髓細(xì)胞1×10~7/只 D組,照射后移植骨髓細(xì)胞和未處理NK細(xì)胞,照射后1h輸注未處理F1代鼠NK 2×10~6/只,4h后輸注F1代鼠骨髓細(xì)胞1×10~7/只 E組,照射后移植骨髓細(xì)胞和RNAi-Ly49處理后NK細(xì)胞,照射后1h輸注siRNA轉(zhuǎn)染后F1代鼠NK 2×10~6/只,4h后輸注F1代鼠骨髓細(xì)胞1×10~7/只。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((?)+S)表示,所用統(tǒng)計(jì)方法主要包括單向方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、生存曲線以Kaplan-Meier法制作,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 第一部分Ly49—H-2信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng) 1,分選所得NK細(xì)胞殺傷活性測定 以小鼠NK細(xì)胞的敏感細(xì)胞株YAC-1為靶細(xì)胞,分選得F1代NK細(xì)胞的殺傷活性隨效靶比升高而增強(qiáng),NK細(xì)胞的殺傷活性正常。5:1時(shí)(24.80±0.85)%,10:1時(shí)為(45.95±2.0g)%,20:1時(shí)為(60.71±1.04)%,40:1時(shí)為(79.54±0.94)%。 2,各組NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)檢測 以C57BL/6鼠源性紅白血病細(xì)胞FBL-3為靶,各組NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性經(jīng)單向方差分析,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=228.390,P=0.000)。以未處理NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)(20.57±1.22)%為基線數(shù)據(jù),抗體阻斷NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)與之相比顯著增強(qiáng)(P=0.000),編輯后NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)與之相比顯著減弱(P=0.000)。FCM測得編輯后NK細(xì)胞組Ly49C(C57BL/6鼠KIR)表達(dá)率為(84.98±1.25)%,與未處理組NK(52.27±2.57)%相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.927,P=-0.000)。抗體阻斷編輯后NK細(xì)胞組殺傷效應(yīng)與編輯后NK細(xì)胞組相比,顯著增強(qiáng)(P=0.000)。 結(jié)果顯示,Allo-NK細(xì)胞可以殺傷YAC-1和FBL-3細(xì)胞,二者對效應(yīng)細(xì)胞的敏感程度不同。NK細(xì)胞的活化狀態(tài)由抑制性信號(hào)和活化性信號(hào)的強(qiáng)度共同決定。腫瘤細(xì)胞編輯誘導(dǎo)KJR(Ly49)表達(dá)上調(diào)可降低NK細(xì)胞殺傷活性,以單克隆抗體14B11阻斷Ly49抑制性信號(hào)通路,促進(jìn)了對沖信號(hào)向激活性信號(hào)的偏移,增強(qiáng)了NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 第二部分RNAi-Ly49影響NK細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng) 1,轉(zhuǎn)染后各組NK細(xì)胞的Ly49C表達(dá) 轉(zhuǎn)染編號(hào)為124、335、91、589的siRNA序列,轉(zhuǎn)染后48h FCM檢測NK細(xì)胞的Ly49C表達(dá)率,分別為(27.48±2.79)%,(52.73±2.14)%,(40.98±4.29)%,(33.26±2.77)%。 2,siRNA干擾后NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 以編號(hào)為124的siRNA序列的抑制率最高,達(dá)48%。干擾后NK細(xì)胞對YAC-1細(xì)胞殺傷活性為(58.77±1.60)%(E:T=20:1),與未處理組(60.71±1.04)%相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(t=1.757,P=0.154)。干擾后NK細(xì)胞對FBL-3細(xì)胞的殺傷活性達(dá)(29.08+2.91)%,與未處理組(20.57+1.22)%相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.664.P=0.010)。 結(jié)果顯示,體外實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染后NK細(xì)胞對YAC-1細(xì)胞殺傷功能與未處理組NK細(xì)胞相比無顯著性差異,結(jié)果和YAC-1細(xì)胞來源品系A(chǔ)/Sn與CB6F1小鼠完全錯(cuò)配相吻合。單倍體相合的FBL-3細(xì)胞則顯示不同情況,轉(zhuǎn)染后NK細(xì)胞KIR表達(dá)下調(diào),使NK細(xì)胞偏向活化的功能狀態(tài),提高了其對FBL-3細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 第三部分RNAi-Ly49影響單倍體相合移植模型中NK細(xì)胞GVL效應(yīng)實(shí)驗(yàn)各組小鼠存活狀態(tài)觀察 A組未作處理,白血病進(jìn)展迅速,小鼠全部于8-11天死亡,生存時(shí)間(9.43±1.06)d B組照射后未做移植,小鼠體重迅速下降,生存時(shí)間(9.23±0.40)d,均死于造血衰竭(WBC＜0.5×10~9/L) C組2只存活超過30天,生存時(shí)間(23.88±8.65)d。 D組4只存活超過30天,生存時(shí)間(30.14±8.56)d,對照未處理組,抑制率=319.62%;對照單純移植組,抑制率=126.21%。 E組5只存活超過30天,生存時(shí)間(33.74±6.71)d,對照未處理組,抑制率=357.79%;對照單純移植組,抑制率=141.29%。 結(jié)果顯示,在荷白血病小鼠模型觀察NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng),以生存期為觀察指標(biāo)推算抑制率,設(shè)未處理的A組為對照,E組抑制率為357.79%,高于D組38.17%;設(shè)未輸注NK細(xì)胞的C組為對照,D組抑制率為126.21%,E組抑制率高過D組15.08%,達(dá)141.29%。說明通過人工誘導(dǎo)KIR錯(cuò)配的方法提高單倍體相合KIR的錯(cuò)配率,進(jìn)一步提升了NK細(xì)胞的GVL效應(yīng)。 結(jié)論 1.體外功能實(shí)驗(yàn),效應(yīng)細(xì)胞NK的活化狀態(tài)由抑制性信號(hào)和活化性信號(hào)的強(qiáng)度共同決定。以單克隆抗體14811阻斷Ly49表達(dá)和RNAi-Ly49干擾抑制性信號(hào)通路傳導(dǎo),促進(jìn)了對沖信號(hào)向激活性信號(hào)的偏移,增強(qiáng)了NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn),荷白血病小鼠模型觀察NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng),以生存期為觀察指標(biāo)推算抑制率:設(shè)未處理的A組為對照,E組抑制率為357.79%,高于D組38.17%;設(shè)未輸注NK細(xì)胞的C組為對照,D組抑制率為126.21%,E組抑制率高過D組15.08%,達(dá)141.29%。說明通過人工誘導(dǎo)KIR錯(cuò)配的方法提高單倍體相合KIR的錯(cuò)配率,提升了NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn):理論方面,提出通過阻斷供者NK細(xì)胞KIR(Ly49)的表達(dá),模擬臨床的KIR錯(cuò)配,誘導(dǎo)供者NK細(xì)胞對受者的殺傷作用,以增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng),降低白血病移植后復(fù)發(fā)率。實(shí)驗(yàn)方法方面,采用的移植模式為F1(C57B/6×BALB/c)(H-2~(b/d),Ly49A~+Ly49C~+)向C57BL/6小鼠(H-2~b,Ly49C~+)骨髓移植,其中Ly49A~+Ly49C~+的供者NK細(xì)胞,在阻斷Ly49C表達(dá)后,保留Ly49A的表達(dá),可以識(shí)別自身的H-2~d,從而在誘導(dǎo)供者NK細(xì)胞對受者白血病細(xì)胞和骨髓細(xì)胞殺傷的同時(shí),保留對自身耐受,以保證供者細(xì)胞能順利植入、實(shí)現(xiàn)造血重建。 研究價(jià)值:本研究為提升NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)找到一個(gè)潛在有效靶點(diǎn),作用于HLA-KIR信號(hào)系統(tǒng),使NK細(xì)胞偏向活化的功能狀態(tài),并可能將這一思路擴(kuò)展到其他免疫效應(yīng)細(xì)胞,為建立遺傳指導(dǎo)下的過繼性細(xì)胞免疫治療方案提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 王春燕;譚獲;郭坤元;;異基因性NK細(xì)胞在小鼠體內(nèi)抗白血病作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年04期

2 管海濤;薛興歡;王西京;李昂;秦兆寅;;靶向survivin的siRNA抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[J];中華腫瘤雜志;2006年05期

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本文編號(hào)：2433950