【摘要】：蜱可傳播人和動(dòng)物的多種疾病病原,特別是森林腦炎、新疆出血熱、萊姆病等人畜共患病,是最重要的人畜共患病傳播媒介之一,嚴(yán)重威脅著人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。蜱的防治成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中迫切需要解決的問題。目前采用的化藥殺蟲劑防治蜱的傳統(tǒng)方法存在蜱耐藥性和環(huán)境污染的缺陷,因此研發(fā)新的防控制劑成為必然趨勢(shì)。本研究擬采用免疫學(xué)方法和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù),克隆、表達(dá)長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和青海血蜱(H. qinghaiensis)的與繁殖發(fā)育相關(guān)的功能基因,為探索蜱生理行為分子調(diào)控機(jī)制、評(píng)價(jià)新型環(huán)境友好害蟲控制制劑和抗蜱疫苗候選抗原提供平臺(tái),填補(bǔ)我國(guó)在蜱生理行為干預(yù)及防控新制劑研究方面的空白,為我國(guó)蜱的防控另辟一條新途徑。主要研究結(jié)果如下： 1)通過免疫學(xué)篩選的方法和RACE技術(shù),在已構(gòu)建的長(zhǎng)角血蜱卵cDNA表達(dá)文庫(kù)和青海血蜱中克隆獲得了20個(gè)有效表達(dá)序列標(biāo)簽(EST),目前獲得了其中12個(gè)基因的全長(zhǎng)序列。為進(jìn)一步解析硬蜱基因編碼蛋白具體的生理作用機(jī)制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ),為研制抗蜱疫苗建立了候選抗原的平臺(tái)。 2)從長(zhǎng)角血蜱卵cDNA文庫(kù)獲得了核糖體蛋白L24的部分序列,通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲得了該基因的全長(zhǎng)序列。實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析表明,該基因在長(zhǎng)角血蜱的各個(gè)組織和發(fā)育階段均表達(dá)；在部分飽血雌蜱中,與其他組織相比,L24主要在卵巢和唾液腺中表達(dá),卵和幼蜱發(fā)育階段的核糖體蛋白L24表達(dá)水平明顯低于其他發(fā)育階段。從青海血蜱和小亞璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)中也分別克隆到了核糖體蛋白L24基因,氨基酸序列比較表明,其同源性較高,只有幾個(gè)氨基酸發(fā)生了變異。HLL24重組蛋白免疫兔體保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫組與對(duì)照組相比,長(zhǎng)角血蜱雌蜱各項(xiàng)生理指標(biāo)下降不顯著。 3)從長(zhǎng)角血蜱卵cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選到了一個(gè)長(zhǎng)角血蜱熱休克蛋白類似物—Hsp70基因。Hsp70基因全長(zhǎng)為2311bp,完整閱讀框長(zhǎng)度為1983bp,編碼661個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為72.5 kDa,等電點(diǎn)為5.2。具有Hsp70家族中高保守功能修飾域和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白中普遍存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)延伸信號(hào)"KDEL"。Hsp70與肩突硬蜱(Ixodes scapularis)Hsp70的氨基酸序列相似性達(dá)90%,與原雞(Gallus gallus)的78kDa葡萄糖調(diào)控蛋白前體(78 kDa glucose-regulated protein precursor)相似性為85%。實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析表明：部分飽血的長(zhǎng)角血蜱雌蜱的卵巢和唾液腺中的Hsp70表達(dá)水平明顯高于其他組織。盡管Hsp70的表達(dá)水平在饑餓長(zhǎng)角血.蜱不同發(fā)育階段表達(dá)水平很低,但通過吸血可明顯誘導(dǎo)其表達(dá)水平的增加。Hsp70的表達(dá)水平與溫度的變化相一致,表現(xiàn)出了明顯的冷熱應(yīng)激典型特征(4℃-37℃)。免疫印跡分析表明：重組長(zhǎng)角血蜱Hsp70蛋白免疫兔體制備的抗體與卵粗抗原的100 kDa、72.5 kDa和28.4 kDa的3條天然蛋白條帶產(chǎn)生明顯反應(yīng),但在部分飽血蜱的蛋白抽提物中只檢測(cè)到一條72.5 kDa的天然蛋白帶與之反應(yīng)。Hsp70重組蛋白的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)表明,該蛋白對(duì)長(zhǎng)角血蜱雌蜱的飽血程度和產(chǎn)卵率的下降作用影響不明顯。綜上所述,盡管Hsp70的表達(dá)水平可明顯通過吸血的生理行為來誘導(dǎo)上調(diào),但定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的長(zhǎng)角血蜱Hsp70作為組成型表達(dá)基因可能不適合于用作抗蜱疫苗候選抗原。 4)采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆了青海血蜱含rabGAP域蛋白(TBC1D13)的全長(zhǎng)序列。TBC1D13基因全長(zhǎng)為1702bp,編碼396個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為46.09 kDa,等電點(diǎn)為6.0。通過建立的各物種TBC1D13發(fā)育遺傳樹和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明：TBC1D13基因的發(fā)育遺傳進(jìn)化保守,蜱源TBC1D13與脊椎動(dòng)物來源TBC1D13形成一個(gè)發(fā)育分支,遠(yuǎn)離于昆蟲TBC1D13的發(fā)育遺傳分支。實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析表明：TBC1D13在青海血蜱雌蜱吸血期間,其于唾液腺中的表達(dá)水平明顯高于其他組織。免疫印跡分析表明,在青海血蜱唾液腺中,天然TBC1D13蛋白的分子量約為49 kDa。重組TBC1D13蛋白免疫兔體誘導(dǎo)了強(qiáng)的免疫反應(yīng),產(chǎn)生了較高的抗體滴度。TBC1D13重組蛋白免疫兔體保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果表明：在統(tǒng)計(jì)學(xué)上,與GST蛋白免疫兔體對(duì)照組相比,攻擊的雌蜱飽血程度和產(chǎn)卵重量都有明顯下降,但該重組蛋白對(duì)宿主動(dòng)物可能產(chǎn)生一定的副作用。因此,盡管TBC1D13基因?qū)η嗪Ｑ绲拇婊顧C(jī)制很關(guān)鍵,但是否可作為疫苗候選抗原對(duì)蜱進(jìn)行防控,其生物安全性還需要在兔體模型和其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392.1;S855.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2425721