【摘要】：蜱可傳播人和動物的多種疾病病原,特別是森林腦炎、新疆出血熱、萊姆病等人畜共患病,是最重要的人畜共患病傳播媒介之一,嚴(yán)重威脅著人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。蜱的防治成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中迫切需要解決的問題。目前采用的化藥殺蟲劑防治蜱的傳統(tǒng)方法存在蜱耐藥性和環(huán)境污染的缺陷,因此研發(fā)新的防控制劑成為必然趨勢。本研究擬采用免疫學(xué)方法和cDNA末端快速擴增技術(shù),克隆、表達長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和青海血蜱(H. qinghaiensis)的與繁殖發(fā)育相關(guān)的功能基因,為探索蜱生理行為分子調(diào)控機制、評價新型環(huán)境友好害蟲控制制劑和抗蜱疫苗候選抗原提供平臺,填補我國在蜱生理行為干預(yù)及防控新制劑研究方面的空白,為我國蜱的防控另辟一條新途徑。主要研究結(jié)果如下： 1)通過免疫學(xué)篩選的方法和RACE技術(shù),在已構(gòu)建的長角血蜱卵cDNA表達文庫和青海血蜱中克隆獲得了20個有效表達序列標(biāo)簽(EST),目前獲得了其中12個基因的全長序列。為進一步解析硬蜱基因編碼蛋白具體的生理作用機制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ),為研制抗蜱疫苗建立了候選抗原的平臺。 2)從長角血蜱卵cDNA文庫獲得了核糖體蛋白L24的部分序列,通過cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)獲得了該基因的全長序列。實時定量RT-PCR分析表明,該基因在長角血蜱的各個組織和發(fā)育階段均表達；在部分飽血雌蜱中,與其他組織相比,L24主要在卵巢和唾液腺中表達,卵和幼蜱發(fā)育階段的核糖體蛋白L24表達水平明顯低于其他發(fā)育階段。從青海血蜱和小亞璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)中也分別克隆到了核糖體蛋白L24基因,氨基酸序列比較表明,其同源性較高,只有幾個氨基酸發(fā)生了變異。HLL24重組蛋白免疫兔體保護性試驗結(jié)果表明,免疫組與對照組相比,長角血蜱雌蜱各項生理指標(biāo)下降不顯著。 3)從長角血蜱卵cDNA表達文庫中篩選到了一個長角血蜱熱休克蛋白類似物—Hsp70基因。Hsp70基因全長為2311bp,完整閱讀框長度為1983bp,編碼661個氨基酸,預(yù)測分子量為72.5 kDa,等電點為5.2。具有Hsp70家族中高保守功能修飾域和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白中普遍存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)延伸信號"KDEL"。Hsp70與肩突硬蜱(Ixodes scapularis)Hsp70的氨基酸序列相似性達90%,與原雞(Gallus gallus)的78kDa葡萄糖調(diào)控蛋白前體(78 kDa glucose-regulated protein precursor)相似性為85%。實時定量RT-PCR分析表明：部分飽血的長角血蜱雌蜱的卵巢和唾液腺中的Hsp70表達水平明顯高于其他組織。盡管Hsp70的表達水平在饑餓長角血.蜱不同發(fā)育階段表達水平很低,但通過吸血可明顯誘導(dǎo)其表達水平的增加。Hsp70的表達水平與溫度的變化相一致,表現(xiàn)出了明顯的冷熱應(yīng)激典型特征(4℃-37℃)。免疫印跡分析表明：重組長角血蜱Hsp70蛋白免疫兔體制備的抗體與卵粗抗原的100 kDa、72.5 kDa和28.4 kDa的3條天然蛋白條帶產(chǎn)生明顯反應(yīng),但在部分飽血蜱的蛋白抽提物中只檢測到一條72.5 kDa的天然蛋白帶與之反應(yīng)。Hsp70重組蛋白的免疫保護性實驗表明,該蛋白對長角血蜱雌蜱的飽血程度和產(chǎn)卵率的下降作用影響不明顯。綜上所述,盡管Hsp70的表達水平可明顯通過吸血的生理行為來誘導(dǎo)上調(diào),但定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的長角血蜱Hsp70作為組成型表達基因可能不適合于用作抗蜱疫苗候選抗原。 4)采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)克隆了青海血蜱含rabGAP域蛋白(TBC1D13)的全長序列。TBC1D13基因全長為1702bp,編碼396個氨基酸,預(yù)測分子量為46.09 kDa,等電點為6.0。通過建立的各物種TBC1D13發(fā)育遺傳樹和氨基酸序列比對結(jié)果表明：TBC1D13基因的發(fā)育遺傳進化保守,蜱源TBC1D13與脊椎動物來源TBC1D13形成一個發(fā)育分支,遠離于昆蟲TBC1D13的發(fā)育遺傳分支。實時定量RT-PCR分析表明：TBC1D13在青海血蜱雌蜱吸血期間,其于唾液腺中的表達水平明顯高于其他組織。免疫印跡分析表明,在青海血蜱唾液腺中,天然TBC1D13蛋白的分子量約為49 kDa。重組TBC1D13蛋白免疫兔體誘導(dǎo)了強的免疫反應(yīng),產(chǎn)生了較高的抗體滴度。TBC1D13重組蛋白免疫兔體保護性試驗結(jié)果表明：在統(tǒng)計學(xué)上,與GST蛋白免疫兔體對照組相比,攻擊的雌蜱飽血程度和產(chǎn)卵重量都有明顯下降,但該重組蛋白對宿主動物可能產(chǎn)生一定的副作用。因此,盡管TBC1D13基因?qū)η嗪Ｑ绲拇婊顧C制很關(guān)鍵,但是否可作為疫苗候選抗原對蜱進行防控,其生物安全性還需要在兔體模型和其他實驗動物模型上進行進一步的評估。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392.1;S855.9

【參考文獻】

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本文編號：2425721