【摘要】： 目的:核酸疫苗是90年代從基因治療研究領域發(fā)展起來的一種新的免疫技術。它可誘導機體產(chǎn)生包括體液免疫應答和細胞免疫應答在內(nèi)的全面的免疫應答,與傳統(tǒng)疫苗相比有許多全新的潛在優(yōu)勢,從而被譽為第三次疫苗革命。目前對于核酸疫苗的研究,主要涉及包括病毒、細菌和原蟲在內(nèi)的多種傳染性病原的預防。但由于其抗原分子小、純化程度高,疫苗的免疫原性不夠理想。因此需要安全有效的佐劑來增強疫苗的效力。有效的免疫佐劑對DNA疫苗的免疫保護作用及發(fā)揮長效免疫效果有增強作用。 CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)中的CpG基序能夠刺激B細胞,T細胞,自然殺傷細胞和抗原提呈細胞發(fā)生免疫級聯(lián)放大反應。CpG-ODN可以誘發(fā)機體產(chǎn)生Th1型免疫反應并能誘導致炎因子的產(chǎn)生。在體內(nèi),骨髓來源的免疫細胞包括單核細胞,巨噬細胞和骨髓來源的樹突細胞均表達TLR9受體,TLR9受體對CpG基序作出反應。溴化二甲基雙十八銨(DDA)是一種陽離子脂質(zhì),作為一種佐劑它可以吸附抗原到它的表面,能增強IFN-γ的分泌和誘發(fā)免疫保護反應,并能增強抗原在體內(nèi)誘導的體液和細胞免疫反應。DDA的作用類似于微膠囊,緩慢釋放包裹的質(zhì)粒載體,從而達到長時間表達抗原的作用,因此在機體抵抗多種疾病中發(fā)揮重要作用。Lipofectamine TM 2000是一種陽離子聚合物,帶凈正電荷的聚合物與帶負電荷的DNA之間相互作用,自發(fā)形成了脂質(zhì)-DNA復合物。脂質(zhì)體-DNA復合物能與細胞表膜和細胞內(nèi)膜直接融合或通過內(nèi)吞作用進入細胞。脂質(zhì)擴散入靶細胞膜的過程,破壞了膜與DNA間的相互作用,從而使DNA進入細胞漿。作為佐劑Lipofectamine TM 2000可以誘導機體產(chǎn)生Th1反應,已被廣泛應用于增強DNA疫苗免疫效果的研究。本室構(gòu)建的犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠誘導了體液免疫和細胞免疫的產(chǎn)生。 為進一步提高pVAX1-CpG-Loop免疫效果,尋求最佳適配佐劑,本次實驗是在本室對核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop的研究基礎上,用佐劑CpG-ODN,DDA和Lipofectamine TM 2000與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop共同免疫小鼠,并檢測其誘導小鼠產(chǎn)生的細胞及體液免疫效果。 方法: 1質(zhì)粒的大量提取 采用SDS-堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒pVAX1 CpG -Loop,采用聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒。并對提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)分光光度計進行純度和濃度測定。將原核表達質(zhì)粒pET28a(+)Loop轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),搖菌并誘導重組Loop蛋白的表達, Western blot鑒定。用尿素溶解沉淀,采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白,透析并復性后濃縮目的蛋白。 2免疫佐劑的準備 CpG-ODN 1826序列為5′TCCATGACGTTC CTGACG TT3′非甲基化,全硫代修飾,PAGE純化。- 20℃保存?zhèn)溆�。PBS溶解并與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop混勻后備用。 DDA溶于pH7.4的10mM Tris-Cl,終濃度為1.25 mg/ml,加熱80℃,20分鐘,并反復顛倒混勻,冷卻到室溫與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop混合后備用。 Lipofectamine TM 2000 40μl/只與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop混合后備用。 3小鼠的免疫方案: 方案1:6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為6組各5只: ①對照組:pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ②CpG-ODN高劑量組: CpG-ODN 50μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ③CpG-ODN低劑量組: CpG-ODN 20μg/只+質(zhì)粒pVAX1-Cp G-Loop 25μg/只。 ④LipofectamineTM 2000組: Lipofectamine TM 2000 40ul/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ⑤DDA高劑量組:DDA 250μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ⑥D(zhuǎn)DA低劑量組:DDA 25μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 小鼠左右股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop并混有相應佐劑,兩周免疫一次,共免疫三次,末次免疫兩周后,無菌取脾,進行T淋巴細胞特異性增殖分析,流式細胞術檢測IFN-γ,蛋白特異性CTL活性分析。 方案2:分組同方案1。小鼠左右股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop并混有相應佐劑,兩周免疫一次,免疫三次后,每組小鼠分別于第十三,十五,十八周用pVAX1-CpG-Loop (25μg/只)加強免疫三次,末次免疫后兩周,無菌取脾,進行T淋巴細胞特異性增殖分析,流式細胞術IFN-γ檢測,蛋白特異性CTL活性分析檢測。免疫后每周尾尖采血,分離血清,ELISA測定血清抗體效價。 方案3:6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為5組每組各5只: ①對照組:pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 ②CpG-ODN高劑量組: CpG-ODN 50μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 ③CpG-ODN低劑量組:CpG-ODN 20μg/只+質(zhì)粒pVAX1 -CpG-Loop 100μg/只。 ④Lipofectamine TM 2000組:Lipofectamine TM 2000 40ul/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 ⑤DDA組:DDA 250μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 小鼠左右股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop (100μg/只)并混有相應佐劑,兩周免疫一次,共免疫三次,末次免疫兩周后,無菌取脾,進行T淋巴細胞特異性增殖分析,流式細胞術檢測IFN-γ,蛋白特異性CTL活性分析。免疫后每周尾尖采血,分離血清,ELISA測定血清抗體效價。 4免疫效果評價 4.1 ELISA測定血清抗體效價免疫后每周尾尖采血,分離血清,以犬傳染性肝炎病毒抗原每孔100μg/ml包被酶標板,4℃過夜。洗滌封閉后加倍比稀釋的小鼠血清100μl,孵育60min后洗滌加HRP標記的二抗孵育60min,OPD顯色。酶標儀492nm波長處測吸光度值 4.2 T淋巴細胞特異性增殖分析采用MTT方法檢測免疫小鼠的T淋巴細胞增殖活性。 4.3流式細胞術檢測IFN-γ的分泌。加入Loop蛋白30μg/ml和10ng/ml interleukin-2孵育72h。收集細胞,加入熒光標記的抗體CD8-PE,IFN-γ-FITC,固定過夜,用流式細胞儀檢測。 4.4蛋白特異性CTL活性分析采用LDH釋放法。 4.4.1效應細胞制備:調(diào)整脾淋巴細胞密度至1×107 /ml ,脾淋巴細胞懸液2ml/孔加入6孔板,加入Loop蛋白30μg/ml和10 ng/ml interleukin-2孵育7天,于第7d收集細胞作為效應細胞,進行特異性殺傷活性測定。 4.4.2靶細胞的制備:胰酶消化CT26細胞,傳代于12孔細胞培養(yǎng)板中,次日進行轉(zhuǎn)染。無血清DMEM稀釋的質(zhì)粒(pVAX1-CpG和pVAX1-CpG-loop)分別與無血清DMEM稀釋的Lipofectamine TM 2000混勻并在室溫下靜置20分鐘。每個孔加混合液200μl, CO2培養(yǎng)箱,37℃5㳠CO2培養(yǎng)48小時。 4.4.3效應細胞對靶細胞的殺傷活性的檢測:上述轉(zhuǎn)染細胞混合作為靶細胞,效應細胞:靶細胞混合比例為100:1, 50:1, 25:1。同時設靶細胞自發(fā)釋放孔和靶細胞最大釋放孔。測492nm波長的吸光值,按下面的公式計算CTL對靶細胞的殺傷活性:實驗組釋放量-自發(fā)釋放量最大釋放量-自發(fā)釋放量 結(jié)果: 1堿裂解法大量提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)雙酶切和1.2㳠瓊脂糖凝膠電泳鑒定,顯示860bp左右的×100%電泳條帶。所得重組質(zhì)粒OD260/OD280在1.8 2.0之間。Western blot結(jié)果顯示誘導表達蛋白與抗六聚組氨酸抗體特異性結(jié)合。誘導表達的Loop蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化,純度可達95%以上。 2將重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop與不同免疫佐劑混合后,免疫小鼠,間接ELISA檢測顯示:各實驗組小鼠所產(chǎn)生的抗體效價明顯高于pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05),各組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 3 T淋巴細胞特異性增殖分析,方案2和方案3的小鼠檢測到T淋巴細胞的增殖活性明顯高于同組的pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。方案1的小鼠無明顯增殖活性(P0.05)。pVAX1-CpG-Loop與CpG-ODN(20μg/只)共免疫組的小鼠脾淋巴細胞的增殖活性明顯高于其他實驗組。 4免疫小鼠脾淋巴細胞經(jīng)流式細胞分析,方案2和方案3的小鼠CD8+T細胞被標記IFN-γ的抗體數(shù)量高于同組的pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。方案2免疫的小鼠CD8+T細胞被標記IFN-γ的抗體數(shù)量高于方案3免疫的小鼠。方案3的小鼠CD8+T細胞被標記IFN-γ的抗體數(shù)量高于方案1免疫小鼠。 5蛋白特異性CTL活性分析結(jié)果顯示,各實驗組小鼠LDH釋放率高于pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。方案2免疫小鼠LDH釋放率高于方案3免疫小鼠。方案3免疫小鼠LDH釋放率高于方案1免疫小鼠。方案2免疫小鼠(25μg/只) DDA與pVAX1-CpG-Loop共免疫組小鼠LDH釋放率高于(250μg/只)DDA與pVAX1-CpG-Loop共免疫組小鼠。 結(jié)論: 1 ELISA檢測:各免疫組小鼠均產(chǎn)生了針對抗原病毒的特異性IgG抗體,且pVAX1-CpG-Loop 100μg/只+ CpG -ODN 20μg/只,pVAX1-CpG-Loop 100μg/只+DDA 250μg/只免疫組的抗體水平明顯高于其它實驗組。以上結(jié)果提示重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop誘導小鼠產(chǎn)生了體液免疫應答,免疫佐劑可有效地增強DNA疫苗誘導的體液免疫應答。 2流式細胞分析顯示:各實驗組小鼠的CD8+T細胞被標記IFN-γ的抗體數(shù)量高于pVAX1-CpG-Loop對照組;采用MTT方法檢測小鼠脾臟的淋巴細胞增殖活性,實驗組小鼠淋巴細胞增殖活性高于pVAX1-CpG-Loop對照組;實驗組小鼠LDH釋放率高于pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。以上結(jié)果提示免疫佐劑能增強重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop誘導小鼠產(chǎn)生特異性的細胞免疫應答。 3 DDA,CPG-ODN,Lipofectamine TM 2000三種免疫佐劑均能增強DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop對小鼠的體液免疫和細胞免疫。方案2免疫的小鼠能夠產(chǎn)生對Loop蛋白特異性免疫記憶。證明免疫佐劑與低劑量DNA疫苗共免疫結(jié)合低劑量DNA疫苗加強免疫的策略是一種非常有效和有潛力的免疫策略。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2425607