【摘要】： 目的:核酸疫苗是90年代從基因治療研究領(lǐng)域發(fā)展起來的一種新的免疫技術(shù)。它可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生包括體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答在內(nèi)的全面的免疫應(yīng)答,與傳統(tǒng)疫苗相比有許多全新的潛在優(yōu)勢,從而被譽為第三次疫苗革命。目前對于核酸疫苗的研究,主要涉及包括病毒、細(xì)菌和原蟲在內(nèi)的多種傳染性病原的預(yù)防。但由于其抗原分子小、純化程度高,疫苗的免疫原性不夠理想。因此需要安全有效的佐劑來增強疫苗的效力。有效的免疫佐劑對DNA疫苗的免疫保護(hù)作用及發(fā)揮長效免疫效果有增強作用。 CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)中的CpG基序能夠刺激B細(xì)胞,T細(xì)胞,自然殺傷細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞發(fā)生免疫級聯(lián)放大反應(yīng)。CpG-ODN可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生Th1型免疫反應(yīng)并能誘導(dǎo)致炎因子的產(chǎn)生。在體內(nèi),骨髓來源的免疫細(xì)胞包括單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和骨髓來源的樹突細(xì)胞均表達(dá)TLR9受體,TLR9受體對CpG基序作出反應(yīng)。溴化二甲基雙十八銨(DDA)是一種陽離子脂質(zhì),作為一種佐劑它可以吸附抗原到它的表面,能增強IFN-γ的分泌和誘發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng),并能增強抗原在體內(nèi)誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。DDA的作用類似于微膠囊,緩慢釋放包裹的質(zhì)粒載體,從而達(dá)到長時間表達(dá)抗原的作用,因此在機(jī)體抵抗多種疾病中發(fā)揮重要作用。Lipofectamine TM 2000是一種陽離子聚合物,帶凈正電荷的聚合物與帶負(fù)電荷的DNA之間相互作用,自發(fā)形成了脂質(zhì)-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物能與細(xì)胞表膜和細(xì)胞內(nèi)膜直接融合或通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)擴(kuò)散入靶細(xì)胞膜的過程,破壞了膜與DNA間的相互作用,從而使DNA進(jìn)入細(xì)胞漿。作為佐劑Lipofectamine TM 2000可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1反應(yīng),已被廣泛應(yīng)用于增強DNA疫苗免疫效果的研究。本室構(gòu)建的犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠誘導(dǎo)了體液免疫和細(xì)胞免疫的產(chǎn)生。 為進(jìn)一步提高pVAX1-CpG-Loop免疫效果,尋求最佳適配佐劑,本次實驗是在本室對核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop的研究基礎(chǔ)上,用佐劑CpG-ODN,DDA和Lipofectamine TM 2000與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop共同免疫小鼠,并檢測其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞及體液免疫效果。 方法: 1質(zhì)粒的大量提取 采用SDS-堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒pVAX1 CpG -Loop,采用聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒。并對提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)分光光度計進(jìn)行純度和濃度測定。將原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)Loop轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),搖菌并誘導(dǎo)重組Loop蛋白的表達(dá), Western blot鑒定。用尿素溶解沉淀,采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白,透析并復(fù)性后濃縮目的蛋白。 2免疫佐劑的準(zhǔn)備 CpG-ODN 1826序列為5′TCCATGACGTTC CTGACG TT3′非甲基化,全硫代修飾,PAGE純化。- 20℃保存?zhèn)溆�。PBS溶解并與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop混勻后備用。 DDA溶于pH7.4的10mM Tris-Cl,終濃度為1.25 mg/ml,加熱80℃,20分鐘,并反復(fù)顛倒混勻,冷卻到室溫與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop混合后備用。 Lipofectamine TM 2000 40μl/只與質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop混合后備用。 3小鼠的免疫方案: 方案1:6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組各5只: ①對照組:pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ②CpG-ODN高劑量組: CpG-ODN 50μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ③CpG-ODN低劑量組: CpG-ODN 20μg/只+質(zhì)粒pVAX1-Cp G-Loop 25μg/只。 ④LipofectamineTM 2000組: Lipofectamine TM 2000 40ul/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ⑤DDA高劑量組:DDA 250μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 ⑥D(zhuǎn)DA低劑量組:DDA 25μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。 小鼠左右股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop并混有相應(yīng)佐劑,兩周免疫一次,共免疫三次,末次免疫兩周后,無菌取脾,進(jìn)行T淋巴細(xì)胞特異性增殖分析,流式細(xì)胞術(shù)檢測IFN-γ,蛋白特異性CTL活性分析。 方案2:分組同方案1。小鼠左右股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop并混有相應(yīng)佐劑,兩周免疫一次,免疫三次后,每組小鼠分別于第十三,十五,十八周用pVAX1-CpG-Loop (25μg/只)加強免疫三次,末次免疫后兩周,無菌取脾,進(jìn)行T淋巴細(xì)胞特異性增殖分析,流式細(xì)胞術(shù)IFN-γ檢測,蛋白特異性CTL活性分析檢測。免疫后每周尾尖采血,分離血清,ELISA測定血清抗體效價。 方案3:6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組每組各5只: ①對照組:pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 ②CpG-ODN高劑量組: CpG-ODN 50μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 ③CpG-ODN低劑量組:CpG-ODN 20μg/只+質(zhì)粒pVAX1 -CpG-Loop 100μg/只。 ④Lipofectamine TM 2000組:Lipofectamine TM 2000 40ul/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 ⑤DDA組:DDA 250μg/只+質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。 小鼠左右股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop (100μg/只)并混有相應(yīng)佐劑,兩周免疫一次,共免疫三次,末次免疫兩周后,無菌取脾,進(jìn)行T淋巴細(xì)胞特異性增殖分析,流式細(xì)胞術(shù)檢測IFN-γ,蛋白特異性CTL活性分析。免疫后每周尾尖采血,分離血清,ELISA測定血清抗體效價。 4免疫效果評價 4.1 ELISA測定血清抗體效價免疫后每周尾尖采血,分離血清,以犬傳染性肝炎病毒抗原每孔100μg/ml包被酶標(biāo)板,4℃過夜。洗滌封閉后加倍比稀釋的小鼠血清100μl,孵育60min后洗滌加HRP標(biāo)記的二抗孵育60min,OPD顯色。酶標(biāo)儀492nm波長處測吸光度值 4.2 T淋巴細(xì)胞特異性增殖分析采用MTT方法檢測免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖活性。 4.3流式細(xì)胞術(shù)檢測IFN-γ的分泌。加入Loop蛋白30μg/ml和10ng/ml interleukin-2孵育72h。收集細(xì)胞,加入熒光標(biāo)記的抗體CD8-PE,IFN-γ-FITC,固定過夜,用流式細(xì)胞儀檢測。 4.4蛋白特異性CTL活性分析采用LDH釋放法。 4.4.1效應(yīng)細(xì)胞制備:調(diào)整脾淋巴細(xì)胞密度至1×107 /ml ,脾淋巴細(xì)胞懸液2ml/孔加入6孔板,加入Loop蛋白30μg/ml和10 ng/ml interleukin-2孵育7天,于第7d收集細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,進(jìn)行特異性殺傷活性測定。 4.4.2靶細(xì)胞的制備:胰酶消化CT26細(xì)胞,傳代于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。無血清DMEM稀釋的質(zhì)粒(pVAX1-CpG和pVAX1-CpG-loop)分別與無血清DMEM稀釋的Lipofectamine TM 2000混勻并在室溫下靜置20分鐘。每個孔加混合液200μl, CO2培養(yǎng)箱,37℃5㳠CO2培養(yǎng)48小時。 4.4.3效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性的檢測:上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合作為靶細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞混合比例為100:1, 50:1, 25:1。同時設(shè)靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔和靶細(xì)胞最大釋放孔。測492nm波長的吸光值,按下面的公式計算CTL對靶細(xì)胞的殺傷活性:實驗組釋放量-自發(fā)釋放量最大釋放量-自發(fā)釋放量 結(jié)果: 1堿裂解法大量提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)雙酶切和1.2㳠瓊脂糖凝膠電泳鑒定,顯示860bp左右的×100%電泳條帶。所得重組質(zhì)粒OD260/OD280在1.8 2.0之間。Western blot結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)蛋白與抗六聚組氨酸抗體特異性結(jié)合。誘導(dǎo)表達(dá)的Loop蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化,純度可達(dá)95%以上。 2將重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop與不同免疫佐劑混合后,免疫小鼠,間接ELISA檢測顯示:各實驗組小鼠所產(chǎn)生的抗體效價明顯高于pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05),各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 3 T淋巴細(xì)胞特異性增殖分析,方案2和方案3的小鼠檢測到T淋巴細(xì)胞的增殖活性明顯高于同組的pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。方案1的小鼠無明顯增殖活性(P0.05)。pVAX1-CpG-Loop與CpG-ODN(20μg/只)共免疫組的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性明顯高于其他實驗組。 4免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞分析,方案2和方案3的小鼠CD8+T細(xì)胞被標(biāo)記IFN-γ的抗體數(shù)量高于同組的pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。方案2免疫的小鼠CD8+T細(xì)胞被標(biāo)記IFN-γ的抗體數(shù)量高于方案3免疫的小鼠。方案3的小鼠CD8+T細(xì)胞被標(biāo)記IFN-γ的抗體數(shù)量高于方案1免疫小鼠。 5蛋白特異性CTL活性分析結(jié)果顯示,各實驗組小鼠LDH釋放率高于pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。方案2免疫小鼠LDH釋放率高于方案3免疫小鼠。方案3免疫小鼠LDH釋放率高于方案1免疫小鼠。方案2免疫小鼠(25μg/只) DDA與pVAX1-CpG-Loop共免疫組小鼠LDH釋放率高于(250μg/只)DDA與pVAX1-CpG-Loop共免疫組小鼠。 結(jié)論: 1 ELISA檢測:各免疫組小鼠均產(chǎn)生了針對抗原病毒的特異性IgG抗體,且pVAX1-CpG-Loop 100μg/只+ CpG -ODN 20μg/只,pVAX1-CpG-Loop 100μg/只+DDA 250μg/只免疫組的抗體水平明顯高于其它實驗組。以上結(jié)果提示重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了體液免疫應(yīng)答,免疫佐劑可有效地增強DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。 2流式細(xì)胞分析顯示:各實驗組小鼠的CD8+T細(xì)胞被標(biāo)記IFN-γ的抗體數(shù)量高于pVAX1-CpG-Loop對照組;采用MTT方法檢測小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞增殖活性,實驗組小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性高于pVAX1-CpG-Loop對照組;實驗組小鼠LDH釋放率高于pVAX1-CpG-Loop對照組(P0.05)。以上結(jié)果提示免疫佐劑能增強重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 3 DDA,CPG-ODN,Lipofectamine TM 2000三種免疫佐劑均能增強DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop對小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫。方案2免疫的小鼠能夠產(chǎn)生對Loop蛋白特異性免疫記憶。證明免疫佐劑與低劑量DNA疫苗共免疫結(jié)合低劑量DNA疫苗加強免疫的策略是一種非常有效和有潛力的免疫策略。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2425607