【摘要】：2010年10月,世界多國報道了“超級細(xì)菌”(“Super- bug”,一種耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌,含NDM-1耐藥基因)引發(fā)感染并導(dǎo)致嚴(yán)重危害的事件。震撼全球的信息再一次將人類的目光聚焦到微生物的進(jìn)化與變異、耐藥與災(zāi)難,這一嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題上。近年來,伴隨著耐藥病原體的不斷出現(xiàn),抗菌藥物和抗菌制劑的開發(fā)、應(yīng)用面臨前所未有的挑戰(zhàn)。突破傳統(tǒng)抗菌技術(shù)的機制,探索和建立新的抗菌技術(shù)是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一項迫切的任務(wù)。噬菌體,作為細(xì)菌的病毒,能夠特異性的感染和裂解細(xì)菌,其裂解宿主菌的效應(yīng)和機制被研究者所關(guān)注。得益于豐富的生物特點,烈性(毒性)噬菌體形態(tài)各異,裂解宿主菌的方式多樣,作用過程巧妙而獨特,是新型抗菌技術(shù)和方法的重要仿生模板,將啟發(fā)我們更多的創(chuàng)新思維。 噬菌體水解酶是噬菌體的關(guān)鍵溶菌成分,觀察和探索其結(jié)構(gòu)和功能對開發(fā)和應(yīng)用噬菌體生物酶有著重要意義。基于此,本研究以前期研究中篩選獲得的新型噬菌體LSB-1為試驗體,采用微生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等方法對此株新型噬菌體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、以及歸類于水解酶系的唾液酸酶(endo-N)的基因及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析。通過以噬菌體T7為載體的重組技術(shù),進(jìn)一步使endo-N基因得到融合、表達(dá)。相關(guān)研究內(nèi)容和結(jié)果如下: 1. LSB-1噬菌體的生物性質(zhì)及分子特征:通過透射電鏡、一步生長曲線及核酸酶切電泳等技術(shù)對噬菌體LSB-1的生物性質(zhì)和分子特征進(jìn)行全面分析,確定LSB-1噬菌體有1個多面體立體對稱的頭部,直徑大約為50±5nm,尾絲長約為60±5nm,屬于短尾噬菌體科(Podoviridae)。噬菌體的5min吸附率為94.3%,潛伏期是23min,平均釋放量為80個。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nhe I酶切產(chǎn)生2條清晰條帶,表明分子量在30kb左右。 2. LSB-1噬菌體宿主識別與裂解關(guān)鍵酶的確定:利用Shotgun基因組測序、ORF Finder、blast、Sequin和MEGA 4等系列生物信息分析技術(shù),完成了噬菌體全基因組測序,驗證了核酸大小約為30kp(dsDNA),有15個主要的功能基因,進(jìn)一步證實噬菌體了LSB-1為一株新的噬菌體;通過同源比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和功能預(yù)測并發(fā)現(xiàn)編碼尾絲蛋白的gp17與噬菌體宿主識別及裂解功能有關(guān),屬于endo-N。 3. Endo-N的結(jié)構(gòu)分析:利用SOPMA、PDB、SWISS-MODEL、PHYRE、RasMol和CN3D 4.1等信息分析技術(shù)對endo-N編碼gp17基因的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,構(gòu)建了LSB-1噬菌體gp17基因的三維結(jié)構(gòu)模型,并成功預(yù)測出其表面活性中心。發(fā)現(xiàn)其三維結(jié)構(gòu)由“Domain A”和“Domain B”兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,N末端位于結(jié)構(gòu)域A,C末端位于結(jié)構(gòu)域B,整個酶分子結(jié)構(gòu)以β折疊為主。其蛋白表面正負(fù)電荷分布區(qū)域相差不大,整個蛋白分子表面電荷基本呈中性。其酶活性中心位于結(jié)構(gòu)域A中,由Glut405,Arg415和Arg487構(gòu)成活性中心。 4. Gp17基因的克隆:對endo-N的編碼基因gp17進(jìn)行擴增,全長基因插入原核表達(dá)載體噬菌體T7,成功構(gòu)建了含gp17的T7-LSB-gp17重組噬菌體。重組噬菌體純化后通過PCR擴增到目的基因,經(jīng)DNA測序驗證,結(jié)果與LSB-1噬菌體的gp17基因核苷酸序列一致,通過蛋白電泳分離出目的條帶,證實T7-LSB-gp17重組噬菌體構(gòu)建成功。 5.噬菌體重組前后效應(yīng)觀察:利用稀釋、雙層瓊脂鋪板、挑取單個噬菌斑法對T7-LSB-gp17重組噬菌體進(jìn)行純化,采用終點滴定法測得重組噬菌體滴度(pfu/ml);重組噬菌體T7-LSB-gp17對大腸桿菌E.coli 8401、E.coli 285和EHEC O157,及其它種屬的金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌繁殖體和類炭疽芽胞桿菌繁殖體均有明顯的溶菌效應(yīng)。 綜上所述,本研究通過對大腸桿菌8401噬菌體LSB-1的分子特征進(jìn)行分析,認(rèn)識其屬于短尾病毒科,30kp的dsDNA噬菌體,存在15個主要的功能基因。其中獲得編碼endo-N的重要功能基因gp17,結(jié)合生物信息學(xué)手段描述了endo-N的三維結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測。結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù),擴增gp17基因,將其插入原核表達(dá)載體噬菌體T7,重組噬菌體T7-LSB-gp17對多種大腸桿菌及其它種屬的金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌繁殖體和類炭疽芽胞桿菌繁殖體均有明顯的溶菌效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2419778