【摘要】：目的構(gòu)建并鑒定高表達(dá)毒力因子ROP18的轉(zhuǎn)基因剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)蟲株。方法 RTPCR擴(kuò)增剛地弓形蟲RH株速殖子的ROP18基因片段。將純化的PCR產(chǎn)物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo載體構(gòu)建p ROP18質(zhì)粒,PCR擴(kuò)增ROP18基因序列。將純化的PCR產(chǎn)物亞克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1載體,構(gòu)建p TUB8-ROP18-Ty1質(zhì)粒。將質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染剛地弓形蟲RH株,剛地弓形蟲懸液轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黃嘌呤的DMEM培養(yǎng)基篩選高表達(dá)ROP18的剛地弓形蟲RH株。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)檢測(cè)ROP18在轉(zhuǎn)基因剛地弓形蟲株中的表達(dá)。吉氏染色比較弓形蟲RH株和高表達(dá)ROP18的轉(zhuǎn)基因RH株弓形蟲分別感染人包皮成纖維細(xì)胞(HFF細(xì)胞)的增殖情況。20只昆明小鼠均分為2組,每鼠分別腹腔內(nèi)注射1×103高表達(dá)ROP18弓形蟲RH株和1×103弓形蟲RH株,統(tǒng)計(jì)小鼠存活率。結(jié)果 RT-PCR擴(kuò)增出1 665 bp的ROP18基因序列。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證明p TUB8-ROP18-Ty1質(zhì)粒構(gòu)建成功。Western blotting分析結(jié)果顯示,高表達(dá)ROP18 RH株可表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為56 000的蛋白,與ROP18-Ty1蛋白預(yù)期結(jié)果一致。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),ROP18-Ty1定位于弓形蟲前端的棒狀體。吉氏染色結(jié)果表明,高表達(dá)ROP18 RH株弓形蟲感染HFF細(xì)胞6、12和24 h后的速殖子數(shù)量分別為100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均顯著高于RH株弓形蟲(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P0.05)。弓形蟲毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RH株弓形蟲感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表達(dá)ROP18 RH株弓形蟲感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。結(jié)論構(gòu)建了高表達(dá)毒力因子ROP18的轉(zhuǎn)基因弓形蟲蟲株。
[Abstract]:Objective to construct and identify transgenic Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) strain with high expression of virulence factor ROP18. Methods the ROP18 gene fragment of Toxoplasma gondii RH was amplified by RTPCR. The purified PCR product was cloned into p CR-Blunt 鈪，

本文編號(hào)：2419596