【摘要】： 前言 腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可分為兩個(gè)階段,當(dāng)腫瘤體積小于1mm3時(shí),主要依靠滲透獲得營(yíng)養(yǎng),即血管前期(prevascular phase),為無(wú)血管生長(zhǎng)期；當(dāng)腫瘤體積大于1mm3時(shí),主要依靠血管生成獲得營(yíng)養(yǎng),即血管期(vascular phase)。 從血管形成的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō),進(jìn)展期的腫瘤應(yīng)該被看作一個(gè)發(fā)育中的器官,血管形成在其過(guò)程中的作用和器官發(fā)生時(shí)同樣重要。如果沒(méi)有充足的血供,缺少生長(zhǎng)所需的氧和其他營(yíng)養(yǎng)成分,腫瘤很難長(zhǎng)大超過(guò)2-3mm3。因此,抗血管生成在腫瘤的治療中顯得尤為重要。 在血管生成過(guò)程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖取決于腫瘤微環(huán)境內(nèi)促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)凋亡二者信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)比。所以,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡能夠抑制腫瘤的血管生成。 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族,能夠選擇性消化廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)和非基質(zhì)蛋白,Ⅳ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白,Ⅳ型膠原酶MMP-2,MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶,在內(nèi)皮血管生成的早期血管基底膜的降解中起重要作用。因此抑制MMP-2和MMP-9的活性可以有效防止血管基底膜的降解,減少腫瘤的血管形成。 欖香烯(elemene)是我國(guó)自行開發(fā)研制的非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物。它是從姜科植物溫郁金(莪術(shù))中提取的以β-欖香烯(化學(xué)名：1-甲基-1-乙烯基-2,4-二異丙基環(huán)己烷)為主要成分的欖香烯類化合物。大量研究表明,欖香烯能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。抑制腫瘤細(xì)胞核酸合成,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化是其作用機(jī)制的一個(gè)主要特點(diǎn)；欖香烯能增強(qiáng)腫瘤的免疫原性,改善和提高荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。此外,欖香烯還具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移、毒副作用小和不易耐藥等優(yōu)點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景。然而,目前關(guān)于β-欖香烯抗腫瘤血管生成的研究較少。 實(shí)驗(yàn)方法 一、細(xì)胞培養(yǎng) 將ECV-304細(xì)胞置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱(FORMA)中培養(yǎng),用0.125%胰酶(含0.02%EDTA)消化,傳代。在細(xì)胞培養(yǎng)及β-欖香烯干預(yù)后,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 二、Matrigel膠檢測(cè)ECV-304細(xì)胞的成血管能力 將ECV-304細(xì)胞接種于24孔板,每孔約1×106個(gè),培養(yǎng)24小時(shí)；棄上清液,分別加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，，160gg/mlβ-欖香烯的培養(yǎng)液,以不含β-欖香烯的孔為對(duì)照組,每濃度平行4孔,繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72小時(shí)。將細(xì)胞用胰酶消化吹打,制成細(xì)胞懸液。將Matrigel膠涂于另一24孔板,每孔30-40μl,涂勻后孵箱內(nèi)靜置30分鐘,待膠凝固,將細(xì)胞懸液接種于涂有Matrigel膠的24孔板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。在倒置顯微鏡下觀察管腔形成情況,每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)管腔數(shù),并取平均值。 三、四唑氮藍(lán)還原反應(yīng)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將ECV-304細(xì)胞以每孔200μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×104/ml)接種于96孔板中,培養(yǎng)24小時(shí),吸出培養(yǎng)液；加入無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí),使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化；再次吸出培養(yǎng)液,分別加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml,160μg/mlβ-欖香烯的培養(yǎng)液,以不含β-欖香烯的孔為對(duì)照組,每濃度平行6孔,繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72小時(shí)。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl,4小時(shí)后孔內(nèi)形成紫色結(jié)晶,每孔加入200μl DMSO溶液終止反應(yīng),振蕩混勻,使結(jié)晶充分溶解,置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)光吸收值(OD),測(cè)定波長(zhǎng)為490nm。四、碘化丙啶(PI)標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將ECV-304細(xì)胞接種于24孔板,每孔1×106個(gè),培養(yǎng)24小時(shí)；棄上清液,分別加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/mlβ-欖香烯的培養(yǎng)液,以不含β-欖香烯的孔為對(duì)照組,每濃度平行4孔,繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72小時(shí)。將細(xì)胞用胰酶消化吹打,制成細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)移至離心管中,1500轉(zhuǎn)/min,離心10分鐘,PBS清洗2次。棄上清,用4℃預(yù)冷的75%乙醇固定,4℃過(guò)夜。1500轉(zhuǎn)/min，離心10分鐘,PBS清洗1次,棄上清,加入終濃度為200μg/ml的RNase A,37℃孵育1小時(shí)；再加入濃度為20gg/ml的PI溶液,4℃避光染色30分鐘。流式細(xì)胞儀上進(jìn)行DNA含量和細(xì)胞周期分析得出細(xì)胞各周期的百分率。 五、Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種、干預(yù)和培養(yǎng)方法見(jiàn)上。β-欖香烯作用細(xì)胞24,48,72h后,棄去上液,用PBS沖洗1次。加入0.25%胰酶消化,1500r/min離心10min,收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗2次。用250μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106。取195μl細(xì)胞懸液,先加入5μl Annexin-V/FITC,室溫避光染色30分鐘后,加入10μl碘化丙錠(PI)溶液,混勻后室溫避光孵育30min。在反應(yīng)管中加入400μl結(jié)合緩沖液,在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。 六、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定ECV-304細(xì)胞中MMP-2,MMP-9的活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml,接種于24孔板,培養(yǎng)24h后離心去上清,加入不同濃度p-欖香烯孵育24，48，72h后收取上清,再按5：1與上樣緩沖液混合,上樣于含0.8g/L聚丙烯酰胺凝膠中。作SDS-PAGE,初始電壓為80V電泳30min,待溴酚藍(lán)達(dá)分離膠后加至150V電泳70-80min。電泳所得凝膠依次洗脫(40分鐘,兩次),漂洗(20分鐘,兩次),孵育(37℃,48小時(shí)),用考馬斯亮藍(lán)染色4h,再脫色。凝膠圖像掃描入計(jì)算機(jī)后即可對(duì)其條帶進(jìn)行半定量分析。 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn),P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、β-欖香烯對(duì)ECV-304細(xì)胞成血管能力的影響 除20μg/mlβ-欖香烯作用于ECV-304細(xì)胞24小時(shí),管腔形成數(shù)目與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異外,其余濃度β-欖香烯作用于內(nèi)皮細(xì)胞24，48，72小時(shí),均可明顯減少ECV-304細(xì)胞形成管腔的數(shù)目,并呈劑量和時(shí)間依賴性。 二、β-欖香烯對(duì)ECV-304細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT法檢測(cè),除20μg/mlβ-欖香烯作用24小時(shí),對(duì)ECV-304細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用外,其余濃度β-欖香烯作用24,48,72小時(shí)對(duì)ECV-304細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用,并呈劑量和時(shí)間依賴性。 三、β-欖香烯對(duì)ECV-304細(xì)胞周期的影響 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),除20μg/mlβ-欖香烯作用于ECV-304細(xì)胞24小時(shí)后,G1期細(xì)胞百分比較對(duì)照組減少,其余濃度β-欖香烯作用于內(nèi)皮細(xì)胞24，48，72小時(shí)后,G1期細(xì)胞明顯增多,而G2期和S期細(xì)胞減少,出現(xiàn)了G1期阻滯,并呈劑量和時(shí)間依賴性。 四、β-欖香烯對(duì)ECV-304細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè),濃度為40μg/ml，80μg/ml，160μg/ml的β-欖香烯作用于ECV-304細(xì)胞24,48,72小時(shí)后,細(xì)胞凋亡百分比明顯增高,呈劑量和時(shí)間依賴性。 五、β-欖香烯對(duì)ECV-304細(xì)胞中MMP-2，MMP-9活性的影響 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示,β-欖香烯濃度為80μg/ml及160μg/ml作用于ECV-304細(xì)胞24，48，72小時(shí)后,MMP-2和MMP-9的活性較對(duì)照組減弱,而濃度為20μg/ml及40μg/ml的β-欖香烯作用24小時(shí),MMP-2和MMP-9的活性與對(duì)照組相比并無(wú)明顯差異。 結(jié)論 1、β-欖香烯可以抑制體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成血管能力,使血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel膠中形成的管腔數(shù)目減少。 2、β-欖香烯可抑制體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,并且凋亡增多。 3、β-欖香烯能夠抑制體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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1 董慶磊;尹鐵英;王貴學(xué);;β-欖香烯在抗動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄方面的潛在應(yīng)用[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2013年03期

本文編號(hào)：2419532