【摘要】： 丁烯酸內酯(Butenolide,BUT)是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種水溶性鐮刀菌毒素,其多侵染與生產(chǎn)、生活密切相關的農(nóng)作物,對人類健康是一種潛在的危害。研究認為,克山病和大骨節(jié)病的病因可能與鐮刀菌毒素對糧食的污染有關,而BUT是病區(qū)糧食中較常見的鐮刀菌毒素。以往的實驗證實,肝臟和心臟是BUT的主要靶器官之一,BUT在體內、體外均可引起動物肝組織明顯的脂質過氧化效應,還可通過對心肌細胞及心肌勻漿明顯的脂質過氧化作用而誘導心肌氧化損傷。金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類存在于細胞內的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白,其在哺乳動物器官中有4種異構形式:MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。MT-Ⅰ/Ⅱ是MT最主要的異構形式。MT在機體拮抗有害重金屬毒性、清除自由基、抗氧化應激、抗凋亡和參與細胞生長調節(jié)等方面均發(fā)揮重要作用。大量研究顯示,MT可明顯抑制自由基引起的氧化損傷。 目前,有關MT對BUT所致氧化損傷的保護作用未見報道。我們利用兩種不同MT表達水平的動物—MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除(MT-/-)小鼠與相應的野生型(MT+/+)小鼠,考察體內MT表達對BUT所致肝組織氧化損傷的影響。研究認為,BUT中毒可能與地方性心肌病—克山病的發(fā)病有關,因此本研究以原代培養(yǎng)的MT+/+小鼠及MT-/-小鼠心肌細胞為研究對象,從氧化應激的角度進一步探討B(tài)UT對心肌的損傷作用,并考察MT對BUT致心肌細胞的毒性是否具有保護作用,并初步探討其作用機制。 本課題將有助于進一步揭示氧化損傷在BUT毒性中的作用,對有效防治BUT的健康危害具有重要的理論與實踐意義。 1金屬硫蛋白對丁烯酸內酯致小鼠肝臟氧化損傷的保護作用既往研究顯示,肝臟是BUT的重要靶器官。本研究利用體外染毒的方式研究MT對BUT所致肝臟氧化損傷的保護作用。將MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織勻漿與不同濃度的BUT(0-200μg/ml)共同孵育1 h,測定肝組織勻漿中脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量。實驗結果顯示,BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織MDA含量增加,呈明顯的劑量-效應關系,與對照組相比具有顯著性差異(P0.01)。MT+/+小鼠與MT-/-小鼠的對比研究顯示,在無BUT作用時,MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織勻漿中MDA含量沒有明顯差異。在BUT作用劑量50-200μg/ml時,兩種動物肝組織中的MDA含量存在顯著性差異,MT-/-小鼠肝勻漿中的MDA明顯高于同一劑量下的MT+/+小鼠,且隨著作用劑量的增加,兩者的差異更為顯著。200μg/ml染毒組MT-/-小鼠肝勻漿中MDA的含量是MT+/+小鼠的1.4倍。由此表明,MT-/-小鼠肝臟MDA的生成顯著大于MT+/+小鼠,MT-/-小鼠肝臟氧化損傷比MT+/+小鼠更為顯著。 我們還觀察了BUT作用的時效關系。將MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織勻漿與100μg/ml BUT共同孵育,分別在0、0.5、1、2、4 h五個時間點檢測肝組織MDA含量。結果顯示,在0-2 h間,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織MDA含量增加,呈明顯的時間-效應關系;隨染毒時間延長至4 h,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織MDA含量均下降,各劑量組與對照組相比均具有顯著性差異(P0.05)。MT+/+小鼠與MT-/-小鼠的對比研究顯示,在無BUT作用時,MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織勻漿中MDA含量沒有明顯差異。BUT作用0.5、1、2和4 h后,MT-/-小鼠肝組織MDA含量分別是MT+/+小鼠的1.5、1.42、1.62和1.64倍。由此表明,隨著BUT染毒時間的延長,MT-/-小鼠肝臟MDA的生成顯著大于MT+/+小鼠。 通過測定肝組織中主要抗氧化物酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性,以及總巰基(TSH)和非蛋白巰基(NPSH)、一氧化氮(NO)的含量,進一步考察MT對BUT致肝臟氧化損傷的保護作用。將MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝臟組織勻漿與不同濃度的BUT(0-200μg/ml)共同孵育1 h,測定各項指標。結果表明,BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織主要抗氧化酶SOD、GSH-Px活性降低。在未經(jīng)毒素處理的情況下,MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織GSH-Px活性就存在一定的差異,MT-/-小鼠肝組織GSH-Px活性高于MT+/+小鼠。為消除兩種小鼠基礎值不同所帶來的差異,我們利用歸一化百分率的方法進行兩種動物的比較,結果顯示,MT-/-小鼠肝組織GSH-Px活性在50、100和200μg/ml劑量時顯著低于MT+/+小鼠(P0.01),200μg/ml染毒組MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝組織GSH-Px的活力分別下降了30%和70%,MT+/+小鼠肝組織GSH-Px的活性是MT-/-小鼠的2.33倍;在25μg/ml至200μg/ml各染毒組中,MT-/-小鼠肝組織SOD活力均顯著低于MT+/+小鼠(P0.05),200μg/ml染毒組MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝組織SOD的活力分別下降了13%和21%。由此說明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性明顯低于MT+/+小鼠。 BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織總巰基(TSH)、非蛋白巰基(NPSH)含量降低,呈明顯劑量-效應關系,且與對照組比較均具有顯著性差異(P0.01),其中以NPSH變化最為明顯。在200μg/ml染毒組中,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織NPSH含量分別下降了95.2%和97.6%。MT+/+小鼠及MT-/-小鼠的對比研究顯示,MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織勻漿中總巰基含量沒有明顯差異,NPSH含量存在顯著性差異,200μg/ml染毒組MT+/+小鼠肝組織NPSH剩余含量是MT-/-小鼠的2.23倍。由此說明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝組織NPSH的消耗明顯多于MT+/+小鼠。 BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織NO含量增高,100和200μg/ml染毒組與對照組比較差異均具有顯著性(P0.01)。MT+/+小鼠及MT-/-小鼠的對比研究顯示,MT-/-小鼠肝組織NO含量在100、200μg/ml劑量時顯著高于MT+/+小鼠(P0.05),200μg/ml染毒組MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝組織NO含量分別升高了2.6倍和4.6倍,MT-/-小鼠肝組織NO含量約是MT+/+小鼠的1.8倍。由此說明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝組織NO的產(chǎn)生明顯多于MT+/+小鼠。 綜上所述,BUT通過抑制MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝臟組織中主要抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性、降低組織中抗氧化物質巰基(TSH和NPSH)的含量、破壞體內抗氧化系統(tǒng)的平衡、使體內自由基清除減少脂質過氧化物的分解產(chǎn)物(MDA)大量蓄積,從而引起肝組織明顯的氧化損傷。說明MT基因敲除后,肝組織內MT缺乏,抗氧化系統(tǒng)清除能力降低,自由基以及脂質過氧化產(chǎn)物含量增高。MT可增強體內抗氧化酶活力,降低非蛋白巰基的損耗,清除自由基,減少脂質過氧化產(chǎn)物MDA的累積,其對BUT所致脂質過氧化效應具有保護作用。 2金屬硫蛋白對丁烯酸內酯致小鼠心肌細胞氧化損傷的保護作用前期研究顯示,BUT能引起心肌細胞明顯的脂質過氧化作用,但其機制尚未闡明。本研究采用原代培養(yǎng)的MT+/+和MT-/-小鼠心肌細胞,進一步研究BUT致心肌細胞氧化損傷的機理,并考察MT對BUT致心肌細胞損傷的保護作用。主要從以下幾個方面對BUT的細胞毒性及MT的保護作用進行評價:細胞形態(tài)、細胞存活率、活性氧產(chǎn)生、DNA損傷等。 實驗結果表明,BUT對心肌細胞有明顯的毒性作用,其對心肌細胞的損傷在形態(tài)上主要表現(xiàn)為:細胞水腫、空泡樣變性、肌纖維斷裂、核固縮、凝固性壞死等。BUT能夠濃度和時間依賴性地降低細胞存活率,且呈現(xiàn)明顯的量效和時效關系,兩種小鼠心肌細胞的相對存活率的對比研究顯示,隨著劑量的增加,兩種小鼠心肌細胞的相對存活率存在顯著性差異(P0.01),MT-/-小鼠心肌細胞細胞存活率明顯低于MT+/+小鼠,說明MT對BUT致小鼠心肌細胞毒性作用有明顯的抑制作用。BUT作用心肌細胞不同時間,MT+/+和MT-/-小鼠心肌細胞培養(yǎng)液中LDH漏出與對照組相比較均無顯著性差異。 為進一步闡明BUT致心肌細胞損傷的機理以及MT的保護作用,本研究利用熒光探針標記方法檢測細胞內ROS生成。通過單細胞凝膠電泳實驗,檢測心肌細胞DNA的損傷情況。結果顯示BUT能夠明顯增加MT+/+和MT-/-小鼠心肌細胞內ROS的產(chǎn)生,兩種小鼠心肌細胞ROS的產(chǎn)生存在差異(P0.05),MT-/-小鼠心肌細胞ROS的產(chǎn)生明顯高于MT+/+小鼠;單細胞凝膠電泳實驗發(fā)現(xiàn),隨著BUT劑量的逐漸增大,MT+/+和MT-/-小鼠心肌細胞DNA損傷不斷增加。綜合細胞內ROS生成檢測結果可說明隨著BUT劑量的不斷增大,細胞內抗氧化系統(tǒng)不能及時清除細胞內ROS,從而造成心肌細胞DNA損傷。通過對兩種小鼠心肌細胞的尾部DNA百分含量,尾長,尾矩等指標進行分析發(fā)現(xiàn),MT-/-小鼠心肌細胞DNA損傷程度大于MT+/+小鼠。由此表明,BUT可誘導細胞內氧化性物質ROS的過量產(chǎn)生,從而引起細胞內明顯的氧化應激,導致細胞內DNA的損傷;而MT通過抑制心肌細胞ROS的產(chǎn)生,減輕心肌細胞DNA損傷,提高心肌細胞的存活率,對BUT所致心肌細胞的毒性作用有著很好的保護作用。 綜上所述,BUT可誘導肝臟、心肌細胞明顯的氧化損傷,而MT通過抑制自由基的產(chǎn)生,增強體內抗氧化能力,從而對BUT所致的氧化損傷具有很好的保護作用。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2417961