【摘要】： 丁烯酸內(nèi)酯(Butenolide,BUT)是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種水溶性鐮刀菌毒素,其多侵染與生產(chǎn)、生活密切相關(guān)的農(nóng)作物,對(duì)人類健康是一種潛在的危害。研究認(rèn)為,克山病和大骨節(jié)病的病因可能與鐮刀菌毒素對(duì)糧食的污染有關(guān),而BUT是病區(qū)糧食中較常見的鐮刀菌毒素。以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí),肝臟和心臟是BUT的主要靶器官之一,BUT在體內(nèi)、體外均可引起動(dòng)物肝組織明顯的脂質(zhì)過氧化效應(yīng),還可通過對(duì)心肌細(xì)胞及心肌勻漿明顯的脂質(zhì)過氧化作用而誘導(dǎo)心肌氧化損傷。金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類存在于細(xì)胞內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白,其在哺乳動(dòng)物器官中有4種異構(gòu)形式:MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。MT-Ⅰ/Ⅱ是MT最主要的異構(gòu)形式。MT在機(jī)體拮抗有害重金屬毒性、清除自由基、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和參與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)等方面均發(fā)揮重要作用。大量研究顯示,MT可明顯抑制自由基引起的氧化損傷。 目前,有關(guān)MT對(duì)BUT所致氧化損傷的保護(hù)作用未見報(bào)道。我們利用兩種不同MT表達(dá)水平的動(dòng)物—MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除(MT-/-)小鼠與相應(yīng)的野生型(MT+/+)小鼠,考察體內(nèi)MT表達(dá)對(duì)BUT所致肝組織氧化損傷的影響。研究認(rèn)為,BUT中毒可能與地方性心肌病—克山病的發(fā)病有關(guān),因此本研究以原代培養(yǎng)的MT+/+小鼠及MT-/-小鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象,從氧化應(yīng)激的角度進(jìn)一步探討B(tài)UT對(duì)心肌的損傷作用,并考察MT對(duì)BUT致心肌細(xì)胞的毒性是否具有保護(hù)作用,并初步探討其作用機(jī)制。 本課題將有助于進(jìn)一步揭示氧化損傷在BUT毒性中的作用,對(duì)有效防治BUT的健康危害具有重要的理論與實(shí)踐意義。 1金屬硫蛋白對(duì)丁烯酸內(nèi)酯致小鼠肝臟氧化損傷的保護(hù)作用既往研究顯示,肝臟是BUT的重要靶器官。本研究利用體外染毒的方式研究MT對(duì)BUT所致肝臟氧化損傷的保護(hù)作用。將MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織勻漿與不同濃度的BUT(0-200μg/ml)共同孵育1 h,測(cè)定肝組織勻漿中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織MDA含量增加,呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P0.01)。MT+/+小鼠與MT-/-小鼠的對(duì)比研究顯示,在無BUT作用時(shí),MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織勻漿中MDA含量沒有明顯差異。在BUT作用劑量50-200μg/ml時(shí),兩種動(dòng)物肝組織中的MDA含量存在顯著性差異,MT-/-小鼠肝勻漿中的MDA明顯高于同一劑量下的MT+/+小鼠,且隨著作用劑量的增加,兩者的差異更為顯著。200μg/ml染毒組MT-/-小鼠肝勻漿中MDA的含量是MT+/+小鼠的1.4倍。由此表明,MT-/-小鼠肝臟MDA的生成顯著大于MT+/+小鼠,MT-/-小鼠肝臟氧化損傷比MT+/+小鼠更為顯著。 我們還觀察了BUT作用的時(shí)效關(guān)系。將MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織勻漿與100μg/ml BUT共同孵育,分別在0、0.5、1、2、4 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝組織MDA含量。結(jié)果顯示,在0-2 h間,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織MDA含量增加,呈明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系;隨染毒時(shí)間延長至4 h,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織MDA含量均下降,各劑量組與對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P0.05)。MT+/+小鼠與MT-/-小鼠的對(duì)比研究顯示,在無BUT作用時(shí),MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織勻漿中MDA含量沒有明顯差異。BUT作用0.5、1、2和4 h后,MT-/-小鼠肝組織MDA含量分別是MT+/+小鼠的1.5、1.42、1.62和1.64倍。由此表明,隨著BUT染毒時(shí)間的延長,MT-/-小鼠肝臟MDA的生成顯著大于MT+/+小鼠。 通過測(cè)定肝組織中主要抗氧化物酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性,以及總巰基(TSH)和非蛋白巰基(NPSH)、一氧化氮(NO)的含量,進(jìn)一步考察MT對(duì)BUT致肝臟氧化損傷的保護(hù)作用。將MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝臟組織勻漿與不同濃度的BUT(0-200μg/ml)共同孵育1 h,測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果表明,BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織主要抗氧化酶SOD、GSH-Px活性降低。在未經(jīng)毒素處理的情況下,MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織GSH-Px活性就存在一定的差異,MT-/-小鼠肝組織GSH-Px活性高于MT+/+小鼠。為消除兩種小鼠基礎(chǔ)值不同所帶來的差異,我們利用歸一化百分率的方法進(jìn)行兩種動(dòng)物的比較,結(jié)果顯示,MT-/-小鼠肝組織GSH-Px活性在50、100和200μg/ml劑量時(shí)顯著低于MT+/+小鼠(P0.01),200μg/ml染毒組MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝組織GSH-Px的活力分別下降了30%和70%,MT+/+小鼠肝組織GSH-Px的活性是MT-/-小鼠的2.33倍;在25μg/ml至200μg/ml各染毒組中,MT-/-小鼠肝組織SOD活力均顯著低于MT+/+小鼠(P0.05),200μg/ml染毒組MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝組織SOD的活力分別下降了13%和21%。由此說明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性明顯低于MT+/+小鼠。 BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織總巰基(TSH)、非蛋白巰基(NPSH)含量降低,呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系,且與對(duì)照組比較均具有顯著性差異(P0.01),其中以NPSH變化最為明顯。在200μg/ml染毒組中,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織NPSH含量分別下降了95.2%和97.6%。MT+/+小鼠及MT-/-小鼠的對(duì)比研究顯示,MT+/+小鼠與MT-/-小鼠肝組織勻漿中總巰基含量沒有明顯差異,NPSH含量存在顯著性差異,200μg/ml染毒組MT+/+小鼠肝組織NPSH剩余含量是MT-/-小鼠的2.23倍。由此說明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝組織NPSH的消耗明顯多于MT+/+小鼠。 BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝組織NO含量增高,100和200μg/ml染毒組與對(duì)照組比較差異均具有顯著性(P0.01)。MT+/+小鼠及MT-/-小鼠的對(duì)比研究顯示,MT-/-小鼠肝組織NO含量在100、200μg/ml劑量時(shí)顯著高于MT+/+小鼠(P0.05),200μg/ml染毒組MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝組織NO含量分別升高了2.6倍和4.6倍,MT-/-小鼠肝組織NO含量約是MT+/+小鼠的1.8倍。由此說明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝組織NO的產(chǎn)生明顯多于MT+/+小鼠。 綜上所述,BUT通過抑制MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝臟組織中主要抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性、降低組織中抗氧化物質(zhì)巰基(TSH和NPSH)的含量、破壞體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡、使體內(nèi)自由基清除減少脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物(MDA)大量蓄積,從而引起肝組織明顯的氧化損傷。說明MT基因敲除后,肝組織內(nèi)MT缺乏,抗氧化系統(tǒng)清除能力降低,自由基以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量增高。MT可增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活力,降低非蛋白巰基的損耗,清除自由基,減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的累積,其對(duì)BUT所致脂質(zhì)過氧化效應(yīng)具有保護(hù)作用。 2金屬硫蛋白對(duì)丁烯酸內(nèi)酯致小鼠心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用前期研究顯示,BUT能引起心肌細(xì)胞明顯的脂質(zhì)過氧化作用,但其機(jī)制尚未闡明。本研究采用原代培養(yǎng)的MT+/+和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞,進(jìn)一步研究BUT致心肌細(xì)胞氧化損傷的機(jī)理,并考察MT對(duì)BUT致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。主要從以下幾個(gè)方面對(duì)BUT的細(xì)胞毒性及MT的保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià):細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率、活性氧產(chǎn)生、DNA損傷等。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BUT對(duì)心肌細(xì)胞有明顯的毒性作用,其對(duì)心肌細(xì)胞的損傷在形態(tài)上主要表現(xiàn)為:細(xì)胞水腫、空泡樣變性、肌纖維斷裂、核固縮、凝固性壞死等。BUT能夠濃度和時(shí)間依賴性地降低細(xì)胞存活率,且呈現(xiàn)明顯的量效和時(shí)效關(guān)系,兩種小鼠心肌細(xì)胞的相對(duì)存活率的對(duì)比研究顯示,隨著劑量的增加,兩種小鼠心肌細(xì)胞的相對(duì)存活率存在顯著性差異(P0.01),MT-/-小鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞存活率明顯低于MT+/+小鼠,說明MT對(duì)BUT致小鼠心肌細(xì)胞毒性作用有明顯的抑制作用。BUT作用心肌細(xì)胞不同時(shí)間,MT+/+和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH漏出與對(duì)照組相比較均無顯著性差異。 為進(jìn)一步闡明BUT致心肌細(xì)胞損傷的機(jī)理以及MT的保護(hù)作用,本研究利用熒光探針標(biāo)記方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成。通過單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn),檢測(cè)心肌細(xì)胞DNA的損傷情況。結(jié)果顯示BUT能夠明顯增加MT+/+和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,兩種小鼠心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生存在差異(P0.05),MT-/-小鼠心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生明顯高于MT+/+小鼠;單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著BUT劑量的逐漸增大,MT+/+和MT-/-小鼠心肌細(xì)胞DNA損傷不斷增加。綜合細(xì)胞內(nèi)ROS生成檢測(cè)結(jié)果可說明隨著BUT劑量的不斷增大,細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)不能及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)ROS,從而造成心肌細(xì)胞DNA損傷。通過對(duì)兩種小鼠心肌細(xì)胞的尾部DNA百分含量,尾長,尾矩等指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),MT-/-小鼠心肌細(xì)胞DNA損傷程度大于MT+/+小鼠。由此表明,BUT可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化性物質(zhì)ROS的過量產(chǎn)生,從而引起細(xì)胞內(nèi)明顯的氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷;而MT通過抑制心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,減輕心肌細(xì)胞DNA損傷,提高心肌細(xì)胞的存活率,對(duì)BUT所致心肌細(xì)胞的毒性作用有著很好的保護(hù)作用。 綜上所述,BUT可誘導(dǎo)肝臟、心肌細(xì)胞明顯的氧化損傷,而MT通過抑制自由基的產(chǎn)生,增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力,從而對(duì)BUT所致的氧化損傷具有很好的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2417961