【摘要】：Ca~(2+)作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，有著重要的生物學(xué)效應(yīng)。其中，鈣庫控制的鈣內(nèi)流（Store-operated Ca~(2+) entry，SOCE）是非興奮性細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的主要機(jī)制，其有著重要的生物學(xué)意義，參與體內(nèi)許多生理反應(yīng)：細(xì)胞內(nèi)鈣庫的充盈，酶類的激活，基因的表達(dá)，細(xì)胞活素類的釋放等。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，STIM1（stromal interaction molecule 1），即基質(zhì)交感分子1，在SOCE中起到很重要的作用。 STIM1最先是由于其腫瘤抑制作用被人們所關(guān)注，其在免疫缺陷病及多類腫瘤中起著重要作用，但是新近的研究發(fā)現(xiàn)STIM1對細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。 STIM1是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白，含有幾個保守的且重要的結(jié)構(gòu)域：位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的EF-hand和sterile a motif（SAM）,測序表明，從蠕蟲到蝶類再到人類EF-hand和SAM是很保守的結(jié)構(gòu)域；位于胞漿中的卷曲螺旋區(qū)和脯氨酸，賴氨酸富集區(qū)。 STIM1N端的EF-hand是一鈣離子感受器--可以感受ER中Ca~(2+)的變化：Ca~(2+)充盈時，EF-hand以單聚體的形式存在，這種單體有著致密的α螺旋結(jié)構(gòu)；當(dāng)Ca~(2+)排空時，EF- hand的緊密螺旋結(jié)構(gòu)減少，促進(jìn)二聚體和低聚物的形成。其它的結(jié)構(gòu)域，如SAM,卷曲螺旋區(qū)和脯氨酸賴氨酸富集區(qū)在STIM1顆粒的轉(zhuǎn)位及激活胞膜上的SOC通道有著至關(guān)重要的作用。 ER利用鈣泵ATP酶行使攝取鈣和儲存鈣的功能, TG，即毒胡蘿卜素，是鈣泵ATP酶的抑制劑，即鈣庫不能攝取鈣并儲存，能夠達(dá)到鈣庫排空的目的。2 ER鈣庫充盈時，通過免疫細(xì)胞化學(xué)或是融合蛋白STIM1-YFP的過表達(dá)方法發(fā)現(xiàn)STIM1主要位于胞漿，其中位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的N端EF-Hand與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca~(2+)結(jié)合。在TG作用下，ER鈣庫排空時，STIM1 EF-Hand與Ca~(2+)解離，STIM1轉(zhuǎn)位于胞膜下，激活胞膜上的SOC通道，從而導(dǎo)致Ca~(2+)內(nèi)流入細(xì)胞引起一系列生理反應(yīng)。 STIM1引起外鈣內(nèi)流入細(xì)胞的過程歸納如下：1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的STIM1作為Ca~(2+)感受器監(jiān)測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的排空；2）隨著鈣庫的排空，STIM1由原來的均勻分布變成聚集分布，形成顆粒，轉(zhuǎn)位至胞膜下；3）轉(zhuǎn)位到胞膜下的STIM1引起胞膜上的Orai1聚集，進(jìn)而激活SOC通道引起外鈣內(nèi)流入細(xì)胞。更具體來說，這種信號傳遞分為四步：1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca~(2+)濃度降低使STIM1的EF-hand和Ca~(2+)解離；2）與Ca~(2+)解離后的STIM1迅速在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成低聚物；3）STIM1低聚物的C端可以指引其向胞膜方向移位；4）移位到胞膜下的STIM1顆粒激活鈣通道。 本實驗使用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western Blot首次檢測到在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞STIM1主要分布于胞漿，在TG作用下STIM1的分布發(fā)生轉(zhuǎn)位，但是在不同的作用時間其轉(zhuǎn)位也有所不同，隨作用時間的增加呈振蕩性分布于胞漿及細(xì)胞核膜。為了進(jìn)一步驗證STIM1在鈣庫排空后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，本實驗將克隆的內(nèi)皮細(xì)胞STIM1并構(gòu)建共GFP融合表達(dá)的GFP-STIM1導(dǎo)入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測其TG刺激后的分布變化。另有報道稱Jurkat T細(xì)胞在TG作用下STIM1發(fā)生胞膜轉(zhuǎn)位并持續(xù)相當(dāng)一段時間。那么，是什么機(jī)制導(dǎo)致兩種細(xì)胞在TG作用下分布變化的不同呢？STIM1在核鈣信號起到怎樣的作用呢？這是本課題組進(jìn)一步研究的內(nèi)容。對于細(xì)胞核內(nèi)的鈣信號研究一直存在爭議，本實驗的深入研究將可能為細(xì)胞核內(nèi)鈣信號調(diào)控機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。 目的：已有研究表明STIM1在鈣庫排空后移位至細(xì)胞膜可引起膜SOC通道開放促使Ca~(2+)內(nèi)流。本文利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western Blot檢測在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核膜或核內(nèi)是否存在STIM1及在鈣庫排空后其轉(zhuǎn)位變化，并探討其對核鈣信號的影響。 方法： 1.用胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用胰蛋白酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。 2.采用細(xì)胞化學(xué)免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞的內(nèi)皮來源。 3.細(xì)胞TG刺激后應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測STIM1的分布。 4.核漿蛋白分離提取和Western Blot檢測STIM1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的分布。 5.細(xì)胞鑒定后,利用轉(zhuǎn)染技術(shù)或是病毒感染使帶熒光的STIM1 cDNA在內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)。 6.用2μM的TG刺激轉(zhuǎn)染或是病毒感染成功的細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡來實時監(jiān)測GFP-STIM1的分布變化，分為兩組：TG刺激組和TG未刺激組。 結(jié)果： 1.細(xì)胞的形態(tài)以及內(nèi)皮細(xì)胞八因子的特異性表達(dá)證實所培養(yǎng)細(xì)胞為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，且純度100%。 2.未刺激前，，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中STIM1主要分布于細(xì)胞胞漿，細(xì)胞核內(nèi)幾乎無表達(dá)。用1μM的TG作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，1分鐘時STIM1分布變化不明顯；3分鐘后STIM1明顯向核膜聚集；10分鐘時STIM1又恢復(fù)到未刺激前的狀態(tài)，即主要分布于胞漿；作用30分鐘時，STIM1再次聚集于核膜；60分鐘時其重新主要分布于胞漿。簡而言之，隨著TG作用時間延長，STIM1的分布呈振蕩性的轉(zhuǎn)位于胞漿與核膜。 3. Western Blot檢測到在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，STIM1表達(dá)于胞漿，核內(nèi)無表達(dá)。 4.通過激光共聚焦顯微鏡，在TG的刺激下檢測到GFP-STIM1的轉(zhuǎn)位變化： TG未刺激組，GFP-STIM1沒有分布變化；TG刺激后，GFP-STIM1由散在均勻分布狀變?yōu)轭w粒狀，并且向核轉(zhuǎn)位。 結(jié)論： 1.胰蛋白酶消化法能夠成功地培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 2.在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，STIM1主要分布于胞漿，TG刺激后，STIM1轉(zhuǎn)位于核，并隨TG作用時間的延長STIM1在胞漿與核膜之間來回轉(zhuǎn)位。 3. GFP-STIM1在TG刺激后發(fā)生轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步證實了STIM1在鈣庫排空后發(fā)生核轉(zhuǎn)位。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：2418006