【摘要】：目的構(gòu)建幽門螺桿菌黏附素Hpa A的原核表達(dá)載體,并用純化的重組Hpa A蛋白進(jìn)行晶體培養(yǎng),為其三維結(jié)構(gòu)解析、基于結(jié)構(gòu)的Hpa A抗原表位分析和黏附拮抗劑研究奠定基礎(chǔ)。方法用生物信息學(xué)方法分析Hpa A蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)并預(yù)測(cè)跨膜區(qū),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC 26695編碼Hpa A蛋白的hp0797基因非跨膜區(qū)片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒并p ET22b(+)-r Hpa A,在大腸桿菌BL21(DE3)中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,經(jīng)Ni離子親和層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析純化蛋白并分析其聚集狀態(tài)。用Hampton Research結(jié)晶試劑盒搜索結(jié)晶條件,并系統(tǒng)優(yōu)化,在上海同步輻射光源進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn)。結(jié)果成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p ET22b(+)-r Hpa A,并在大腸桿菌BL21(DE3)中可溶性表達(dá);重組Hpa A蛋白在溶液中以二聚體形式存在,SDS-PAGE分析單體相對(duì)分子質(zhì)量約24 000,HPLC分析純度達(dá)95%;培養(yǎng)出晶形較好的重組Hpa A蛋白單晶,大小約70μm×30μm×20μm,衍射分辨率2.03沘。結(jié)論利用經(jīng)典的蛋白質(zhì)表達(dá)、純化技術(shù)和晶體培養(yǎng)技術(shù),獲得了衍射能力較強(qiáng)的重組Hpa A蛋白單晶,為其三維結(jié)構(gòu)解析和基于結(jié)構(gòu)的幽門螺桿菌疫苗研究提供了重要基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct the prokaryotic expression vector of Helicobacter pylori adhesin Hpa A and culture it with purified recombinant Hpa A protein for three-dimensional structural analysis, structural epitope analysis of Hpa A and study of adhesion antagonist. Methods the secondary structure of Hpa A protein sequence was analyzed by bioinformatics and the transmembrane region was predicted. The non-transmembrane region of hp0797 gene encoding Hpa A protein in Helicobacter pylori standard strain NCTC 26695 was amplified by PCR technique. The recombinant plasmid was constructed and p ET22b ()-r Hpa A, was induced by IPTG to express the recombinant protein in BL21 (DE3). The recombinant protein was purified by Ni ion affinity chromatography, anion exchange chromatography and gel filtration chromatography. The crystallization conditions were searched by Hampton Research crystallization kit and optimized systematically. The diffraction experiments were carried out at Shanghai Synchrotron radiation light source. Results the recombinant plasmid p ET22b ()-r Hpa A, was successfully constructed and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant Hpa A protein exists in the form of dimer in the solution, and the relative molecular weight of the SDS-PAGE analytical monomer is about 24000. The purity of the recombinant Hpa A protein is 95. The crystal size of the recombinant Hpa A protein is about 70 渭 m 脳 30 渭 m 脳 20 渭 m, and the diffractive resolution is 2.03 Bir. Conclusion Recombinant Hpa A single crystal was obtained by classical protein expression, purification and crystal culture techniques, which provides an important basis for three-dimensional structure analysis and structure-based study of Helicobacter pylori vaccine.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)全軍免疫學(xué)研究所;第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系微生物與生化藥學(xué)教研室;北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部人體解剖與組織胚胎學(xué)系;第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)教研室;
【基金】：863計(jì)劃(2012AA02A407) 國(guó)家自然科學(xué)基金(81572810) 重慶市基礎(chǔ)與前沿一般項(xiàng)目(CSTC2013JCYJA1037)
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 張萬岱;胡伏蓮;蕭樹東;徐智民;;中國(guó)自然人群幽門螺桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查[J];現(xiàn)代消化及介入診療;2010年05期

2 ;Frequencies of the expression of main protein antigens from Helicobacter pylori isolates and production of specific serum antibodies in infected patients[J];World Journal of Gastroenterology;2005年03期

3 王靜;王蔚虹;;幽門螺桿菌定植相關(guān)致病因子研究進(jìn)展[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2010年02期

4 Lucia Pacifico;John F Osborn;Valeria Tromba;Sara Romaggioli;Stefano Bascetta;Claudio Chiesa;;Helicobacter pylori infection and extragastric disorders in children: A critical update[J];World Journal of Gastroenterology;2014年06期

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高承霞;嚴(yán)祥;韓儉;魏蓮花;王瓊;;苦豆子生物堿對(duì)幽門螺桿菌耐藥株的體外抑菌研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年11期

2 章玉濤;王加啟;趙圣國(guó);孫鵬;卜登攀;周凌云;李發(fā)弟;;抗幽門螺桿菌UreB蛋白免疫乳的制備[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年04期

3 趙林;毛朝亮;吳旭;許晴晴;;貴州省遵義地區(qū)幽門螺桿菌感染及耐藥性調(diào)查研究(附332例報(bào)告)[J];貴州醫(yī)藥;2012年07期

4 張勇;李錦霞;;有消化道癥狀兒童幽門螺旋桿菌現(xiàn)癥感染的調(diào)查[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2012年09期

5 胡紀(jì)文;熊建輝;張永頂;;幽門螺桿菌IgG抗體免疫層析分型方法的建立[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2012年20期

6 舒穎;張平安;魏新素;葉芳麗;楊相升;;武漢市體檢人群幽門螺桿菌感染調(diào)查及對(duì)血脂代謝的影響[J];公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué);2012年06期

7 高承霞;嚴(yán)祥;韓儉;王瓊;;E-test法檢測(cè)幽門螺桿菌對(duì)3種抗生素的耐藥性[J];國(guó)際消化病雜志;2013年01期

8 吳煒景;李立平;林延超;陳婷婷;謝子英;馬艷春;趙亞剛;;廣東地區(qū)胃竇潰瘍患者幽門螺桿菌CagA基因型與中醫(yī)證型相關(guān)性分析[J];中華中醫(yī)藥雜志;2013年06期

9 梁曉萍;楊煥麗;張粉娟;邵明明;武永紅;;咸陽地區(qū)上消化道疾病患者幽門螺桿菌感染狀況分析[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2013年16期

10 王宏彥;徐寶宏;吳海波;;10日序貫療法與四聯(lián)療法治療幽門螺桿菌感染療效對(duì)比分析[J];中國(guó)醫(yī)藥科學(xué);2013年16期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 朱振坤;汪金云;王巧燕;孫正林;田翔;;胃腸病患者幽門螺桿菌感染狀況及耐藥性分析[A];全國(guó)高血壓防治知識(shí)推廣培訓(xùn)班暨健康血壓中國(guó)行福建漳州會(huì)論文綜合刊[C];2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 石紹順;消化性潰瘍的中醫(yī)證治規(guī)律研究及臨床療效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2011年

2 葉峰;幽門螺桿菌脂多糖調(diào)控胃癌細(xì)胞的miR-375、miR-106b表達(dá)及其機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年

3 王瑞峰;功能性消化不良上腹痛綜合征的癥狀學(xué)特點(diǎn)及病理生理機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

4 李海波;基于多亞單位Th表位的幽門螺桿菌疫苗的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 劉宇;荊花胃康膠丸及其拆方抗耐藥幽門螺桿菌作用和機(jī)制研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

6 鄧?yán)?功能性消化不良近端胃功能及病理生理機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

7 趙卓;金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位及表位疫苗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

8 謝建輝;廣藿香醇抗幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎機(jī)理研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

9 陳立;幽門螺桿菌和甲型流感病毒特異性CD4~+T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

10 蘇鵬;中國(guó)三地幽門螺桿菌cagPAI序列多態(tài)性分析[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡秀娟;幽門螺桿菌感染危險(xiǎn)因素分析及不同根治方案評(píng)析[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 黃永琴;反復(fù)腹痛患兒及家庭成員幽門螺桿菌感染和外周血淋巴細(xì)胞亞群的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

3 趙欽;幽門螺桿菌相關(guān)性胃病中醫(yī)證候分布規(guī)律的研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2011年

4 王立剛;大連市海港集團(tuán)職工幽門螺桿菌感染現(xiàn)狀及相關(guān)因素調(diào)查研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

5 黃爭(zhēng);清熱解毒法治療胃癌前病變的隨機(jī)對(duì)照研究及對(duì)p53、Ki67、APC蛋白表達(dá)的影響[D];浙江中醫(yī)藥大學(xué);2011年

6 梁堂帥;蒙古沙鼠感染幽門螺桿菌后胃黏膜Galectin-9、Tim-3表達(dá)水平的分析[D];吉林大學(xué);2012年

7 高承霞;苦豆子生物堿對(duì)Hp臨床耐藥株的體外抑菌研究[D];蘭州大學(xué);2012年

8 周偉;河西走廊地域流行幽門螺桿菌菌庫建立、耐藥狀況及重要毒力基因分型研究[D];蘭州大學(xué);2012年

9 王皓云;健脾清化法聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)根除Hp臨床療效觀察[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

10 李寧一;HLA-DRB1等位基因多態(tài)性與幽門螺桿菌感染及胃部疾病的相關(guān)性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 徐智民;潘俊輝;宋衛(wèi)生;孫勇;賴卓勝;王亞東;張萬岱;;幽門螺桿菌尿素酶金標(biāo)抗體檢查法與~(14)C-尿素呼氣試驗(yàn)檢測(cè)幽門螺桿菌感染的對(duì)照研究[J];現(xiàn)代消化及介入診療;2003年03期

2 Hajime Isomoto;Hiroaki Ueno;Yoshito Nishi;Masamitsu Nakazato;Shigeru Kohno;;Impact of Helicobacter pylori infection on ghrelin and various neuroendocrine hormones in plasma[J];World Journal of Gastroenterology;2005年11期

3 Mehmet Cindoruk;Ilhan Yetkin;Serpil Muge Deger;Tarkan Karakan;Erdal Kan;Selahattin Unal;;Influence of H pylori on plasma ghrelin in patients without atrophic gastritis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年10期

4 Konstantinos X Papamichael;Garyphallia Papaioannou;Helen Karga;Anastasios Roussos;Gerassimos J Mantzaris;;Helicobacter pylori infection and endocrine disorders:Is there a link?[J];World Journal of Gastroenterology;2009年22期

5 ;Does Helicobacter pylori infection play a role in iron deficiency anemia? A meta-analysis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年07期

6 Lucia Pacifico;Caterina Anania;John F Osborn;Flavia Ferraro;Claudio Chiesa;;Consequences of Helicobacter pylori infection in children[J];World Journal of Gastroenterology;2010年41期

7 ;Influence of Helicobacter pylori infection on ghrelin levels in children[J];World Journal of Gastroenterology;2012年36期

8 Yao-Jong Yang;Bor-Shyang Sheu;Hsiao-Bai Yang;Ching-Chun Chuang;;Eradication of Helicobacter pylori increases childhood growth and serum acylated ghrelin levels[J];World Journal of Gastroenterology;2012年21期

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 鄭輝;陳村元;歐陽健明;;酒石酸鎂對(duì)水合草酸鈣晶體生長(zhǎng)的調(diào)控作用[J];高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào);2006年07期

2 李生廣,楊樹長(zhǎng),杜泉,陳宏雷,林治煥;超大分子F_1-ATP酶空間晶體生長(zhǎng)預(yù)實(shí)驗(yàn)[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;1998年05期

3 陳金瑤;任國(guó)賓;洪鳴凰;齊明輝;;鹽酸帕羅西汀結(jié)晶過程控制研究.Ⅱ.晶體生長(zhǎng)機(jī)制[J];中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志;2012年07期

4 吳伸,陳毓荃,呂志強(qiáng),閆軍,董貽誠(chéng);栝樓籽核糖體失活蛋白的純化、性質(zhì)及晶體生長(zhǎng)研究[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);1998年04期

5 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 金蔚青;;二十一世紀(jì)晶體生長(zhǎng)機(jī)理研究的新概念——無量綱參數(shù)研究材料制備科學(xué)[A];第15屆全國(guó)晶體生長(zhǎng)與材料學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

2 馬建華;倉懷興;;空間蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)新技術(shù)[A];第十一次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

3 管榮津;王淼;楊娜;王大成;;兩性表面活性劑在優(yōu)化可溶性蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)中的應(yīng)用[A];第九次全國(guó)生物物理大會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2002年

4 申少華;方克明;張術(shù)根;王大偉;;水熱體系X型沸石晶體生長(zhǎng)的影響因素[A];中國(guó)硅酸鹽學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2003年

5 郝保紅;方克明;;從晶體生長(zhǎng)機(jī)理分析晶須制備的可控性研究[A];中國(guó)顆粒學(xué)會(huì)2006年年會(huì)暨海峽兩岸顆粒技術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

6 付靜怡;林樹坤;;幾種馬來酸氫長(zhǎng)碳鏈酯分光晶體生長(zhǎng)及動(dòng)力學(xué)研究[A];第14屆全國(guó)晶體生長(zhǎng)與材料學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

7 陳萬春;;水溶液晶體的空間生長(zhǎng)及其地基模擬實(shí)驗(yàn)[A];《硅酸鹽學(xué)報(bào)》創(chuàng)刊50周年暨中國(guó)硅酸鹽學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2007年

8 張懷金;郝良振;武奎;于浩海;王正平;王繼揚(yáng);;高溫氧化物光浮區(qū)晶體生長(zhǎng)[A];第十六屆全國(guó)晶體生長(zhǎng)與材料學(xué)術(shù)會(huì)議論文集-03激光和非線性光學(xué)晶體[C];2012年

9 趙波;王t$;;晶體生長(zhǎng)(鑄錠)技術(shù)發(fā)展[A];多晶硅及太陽能電池技術(shù)發(fā)展研討會(huì)論文集[C];2011年

10 夏長(zhǎng)泰;李東振;周大華;王璐璐;賽青林;狄聚青;;半導(dǎo)體照明:晶體生長(zhǎng)技術(shù)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[A];第十六屆全國(guó)晶體生長(zhǎng)與材料學(xué)術(shù)會(huì)議論文集-02半導(dǎo)體材料器件及應(yīng)用[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前7條

1 楊志奇;第十六屆國(guó)際晶體生長(zhǎng)會(huì)議在京召開[N];中國(guó)建材報(bào);2010年

2 記者 王桂蘭;第三屆亞洲晶體生長(zhǎng)與晶體技術(shù)會(huì)議舉行[N];中國(guó)建材報(bào);2005年

3 范文忠;上虞有種“煉丹爐”能“煉”出神奇寶貝[N];杭州日?qǐng)?bào);2007年

4 高琴偉;晶龍晶體生長(zhǎng)設(shè)備替代進(jìn)口[N];中國(guó)企業(yè)報(bào);2008年

5 薛福勇　馮月劍;自主研發(fā)抵御產(chǎn)業(yè)“寒冬”[N];首都建設(shè)報(bào);2012年

6 基因潮綜合報(bào)道;航天生物產(chǎn)業(yè)與“神舟”齊飛[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2002年

7 ;“神舟”二號(hào)飛船（新聞資料）[N];人民日?qǐng)?bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 高文蘭;馳豫鐵電鈮酸鈣鋇系列晶體生長(zhǎng)與性能研究[D];山東大學(xué);2010年

2 陳天華;仿生物礦化模板法調(diào)控晶體生長(zhǎng)機(jī)理與試驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2012年

3 謝會(huì)東;含鉍功能晶體生長(zhǎng)與性質(zhì)研究[D];清華大學(xué);2007年

4 陳捷;上稱重法生長(zhǎng)摻稀土鎢酸釓鉀及若干新晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制備[D];福州大學(xué);2010年

5 李國(guó)華;納米TiO_2（金紅石銳鈦礦）粉體晶相控制研究與晶體生長(zhǎng)界面相模型[D];中南大學(xué);2001年

6 申少華;廉價(jià)礦物原料水熱法制備沸石分子篩的形成機(jī)理與晶體生長(zhǎng)模型研究[D];中南大學(xué);2001年

7 汪盛;用原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)及成核研究[D];重慶大學(xué);2003年

8 魯路;大尺寸CsB_3O_5晶體生長(zhǎng)及應(yīng)用研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（理化技術(shù)研究所）;2008年

9 于永貴;幾種氧化物晶體的數(shù)值模擬、生長(zhǎng)及性質(zhì)研究[D];山東大學(xué);2009年

10 那木吉拉圖;新型紫外可調(diào)諧激光材料氟化物晶體生長(zhǎng)與性能的研究[D];天津大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張亮;晶體生長(zhǎng)中的計(jì)算機(jī)控制研究[D];長(zhǎng)春理工大學(xué);2005年

2 蔣宛莉;中國(guó)古代晶體生長(zhǎng)史初探[D];山東大學(xué);2007年

3 曾小平;大型晶體生長(zhǎng)系統(tǒng)（設(shè)備）關(guān)鍵技術(shù)研究[D];西安理工大學(xué);2008年

4 鄧子夏;納米硒溶膠對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的調(diào)控作用[D];暨南大學(xué);2012年

5 徐棟;溫度場(chǎng)移動(dòng)式數(shù)控高精密晶體生長(zhǎng)爐研究[D];山東理工大學(xué);2014年

6 施瓊;新型硫?qū)倩衔锏暮铣伞⒕w生長(zhǎng)與性質(zhì)研究[D];山東大學(xué);2012年

7 程鵬;反乳液沉淀反應(yīng)中晶體生長(zhǎng)的可視化研究[D];北京化工大學(xué);2009年

8 王延軍;晶體生長(zhǎng)超低速控制技術(shù)的研究[D];北京化工大學(xué);2009年

9 尚廣亮;雙摻雜鎢酸鉛晶體生長(zhǎng)及結(jié)構(gòu)特性的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2006年

10 阮華棚;磷硅化合物合成、晶體生長(zhǎng)及性能表征[D];山東大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：2415329