【摘要】： 背景與目的 炎癥是人類多種疾病中一種最常見的病理過程,可發(fā)生于機(jī)體的任何部位和組織,是機(jī)體對感染或創(chuàng)傷等引起的內(nèi)環(huán)境紊亂的正常反應(yīng)。但是過度的炎癥反應(yīng)會引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥,導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞自身性損害,表現(xiàn)為膿毒癥,膿毒性休克甚至多器官功能障礙綜合征。臨床上革蘭氏陰性菌感染引起的炎癥反應(yīng)損傷是一種常見疾病,往往難于控制,嚴(yán)重時可引起內(nèi)毒素血癥或感染性休克,危及病人生命。革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的活性成分內(nèi)毒素即脂多糖(LPS)是引發(fā)急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵致病物質(zhì),它能激活機(jī)體單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng),產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì),導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。新近發(fā)現(xiàn)并廣為研究的Toll樣受體2(TLR2)與LPS引起的免疫反應(yīng)及其導(dǎo)致的機(jī)體損傷有很大的關(guān)系,TLR2識別的配體最多,參與人體內(nèi)對LPS的反應(yīng),介導(dǎo)炎癥信號傳入胞內(nèi)激發(fā)一系列炎癥反應(yīng),在識別各種病原微生物引發(fā)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中扮演重要的角色。現(xiàn)已證實多種致炎細(xì)菌成分都直接或間接激活TLR2繼而使白細(xì)胞活化,白細(xì)胞活化后,一方面殺滅細(xì)菌,另一方面又釋放多種致炎介質(zhì)和細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng),劇烈過度的全身性炎癥反應(yīng)則可影響多個臟器并最終導(dǎo)致不可逆的病理損傷。因此,阻斷或抑制TLR2的激活,則有可能抑制白細(xì)胞的活化,阻斷白細(xì)胞炎性介質(zhì)的合成與分泌,避免多種細(xì)菌成分導(dǎo)致的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的發(fā)生。由于可溶性TLR2胞外區(qū)蛋白(sTLR2)具有和白細(xì)胞膜上天然的TLR2受體胞外區(qū)相同的與細(xì)菌成分相結(jié)合的能力,理論上sTLR2可以通過競爭性抑制白細(xì)胞膜上相應(yīng)受體的激活,從而阻止白細(xì)胞活化和釋放炎性介質(zhì)進(jìn)而達(dá)到抗炎治療的目的�；诖�,本實驗采用腺病毒表達(dá)策略,首先克隆人TLR2胞外區(qū)基因,然后制備攜帶TLR2胞外區(qū)基因的重組腺病毒載體,獲得可以表達(dá)sTLR2的高滴度純化病毒,觀察重組腺病毒介導(dǎo)sTLR2在動物模型體內(nèi)的抗炎作用,以探明sTLR2的抗炎機(jī)制,為急性炎癥反應(yīng)的防治提供新的思路和治療策略。 研究方法 1.分離健康人外周血單個核細(xì)胞,提取其RNA作為模板采用RT-PCR方法擴(kuò)增人TLR2胞外區(qū)cDNA。目的基因經(jīng)純化后將其亞克隆至pUCm-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCm-TLR2,選取鑒定正確的克隆測序,并將測序結(jié)果與GenBank中人TLR2胞外區(qū)基因序列進(jìn)行同源性比較分析。 2.將測序正確的TLR2胞外區(qū)目的片段定向克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TLR2,將陽性重組子酶切線性化后轉(zhuǎn)化感受態(tài)AdEasier-1細(xì)菌,在E.coli BJ5183內(nèi)與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR2。 3.將鑒定正確的重組質(zhì)粒pAd-TLR2以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中進(jìn)行包裝并且擴(kuò)增病毒。觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá),純化并測定病毒滴度,以PCR方法鑒定重組腺病毒并進(jìn)行野生型病毒檢測分析其應(yīng)用的安全性。 4.建立致死劑量LPS所致炎癥動物模型;40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A和B兩個實驗組,重組腺病毒AdTLR2于致炎之前(A實驗組)和致炎之后(B實驗組)分別作用于炎癥小鼠,觀察其對小鼠生存時間的影響。 5.建立小劑量LPS所致炎癥動物模型;40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組:正常對照組(尾靜脈注射0.9%生理鹽水)、炎癥對照組(腹腔緩慢注射小劑量LPS溶液)、重組腺病毒AdTLR2 A組(LPS致炎之前尾靜脈注射病毒懸液)、重組腺病毒AdTLR2 B組(LPS致炎之后尾靜脈注射病毒懸液)。觀察48h后,摘眼球取血,分離血清,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量變化進(jìn)行檢測,探討AdTLR2對小鼠血清細(xì)胞因子水平變化的影響。 結(jié)果 1.從健康人外周血單個核細(xì)胞中應(yīng)用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增TLR2胞外區(qū)cDNA,并且成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCm-TLR2。 2.經(jīng)測序及序列同源性比較,本實驗所克隆的目的片段長度為1764bp,測序結(jié)果無堿基突變與GenBank中人TLR2胞外區(qū)基因序列完全吻合。 3.經(jīng)雙酶切及DNA測序鑒定,證實插入序列和讀碼框架正確,重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TLR2構(gòu)建成功。 4.重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒通過在E.coli BJ5183內(nèi)的同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR2,經(jīng)PacⅠ酶切后可見一條約30kb大小的條帶和一條4.5kb的特征性條帶,表明同源重組成功。 5.將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR2轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的綠色熒光,并且出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE),說明重組腺病毒包裝成功。 6.擴(kuò)增后收集病毒,經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化獲得3×109 PFU/mL的高滴度重組腺病毒AdTLR2,以PCR鑒定其攜帶有所克隆入的TLR2胞外區(qū)目的基因,并且經(jīng)檢測無野生型病毒存在。 7. BALB/c小鼠經(jīng)腹腔注射LPS后成功復(fù)制內(nèi)毒素血癥炎癥動物模型,制備的重組腺病毒AdTLR2對小鼠無明顯的毒性作用,實驗動物對病毒耐受良好。 8.重組腺病毒AdTLR2作用于致死劑量LPS所致炎癥動物模型后,A實驗組和B實驗組小鼠的生存時間與炎癥對照組比較相對延長。 9.重組腺病毒AdTLR2作用于小劑量LPS所致炎癥動物模型后,AdTLR2 A組和AdTLR2 B組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的血清水平均較炎癥對照組有所降低,差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),AdTLR2 A組與AdTLR2 B組數(shù)據(jù)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.成功克隆TLR2胞外區(qū)基因cDNA全部編碼序列,經(jīng)測序及序列同源性比較,證實目的基因無堿基突變與GenBank中所提供的相關(guān)序列完全吻合。 2.應(yīng)用AdEasy System腺病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建攜帶有TLR2胞外區(qū)基因的重組腺病毒載體AdTLR2,經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、純化后獲得3×109 PFU/mL的高滴度重組腺病毒,此在國內(nèi)外尚未見報道。 3.制備的重組腺病毒AdTLR2能夠使LPS所致炎癥小鼠模型的生存時間相對延長,并且能夠降低炎癥小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,提示AdTLR2在活體內(nèi)可以分泌sTLR2蛋白并且發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用,能夠抑制血清中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平,具有一定的抗炎作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2415201