【摘要】： 高密度脂蛋白很早以前就被證明能夠中和內(nèi)毒素的毒性。載脂蛋白A-I是高密度脂蛋白中主要的蛋白成分,因此其在中和內(nèi)毒素毒性方面上發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。根據(jù)載脂蛋白A-I的兩個天然突變體的突變位點(diǎn)及Edmunson輪,我們課題組利用PET表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功構(gòu)建出包括天然突變體ApoA-Imilano在內(nèi)的七個半胱氨酸突變體,分別為A-I(S52C)、A-I(N74C)、A-I(K107C)、A-I(G129C)、A-I_M(R173C)、A-I(K195C)、A-I(S228C)。實(shí)驗(yàn)證明,這些突變體無論是在二級結(jié)構(gòu)還是體外功能上都不盡相同,這就增加了突變后會影響其體內(nèi)功能的可能性。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 本研究對野生型apoA-I和分別發(fā)生在apoA-I多肽鏈7個α螺旋片段上的半胱氨酸突變體結(jié)合脂質(zhì)后生成的八種重組高密度脂蛋白(rHDLwt,rHDL52,rHDL74,rHDL107,rHDL129,rHDL173,rHDL195和rHDL228)的抗炎性能做了比較,以觀察這些特定的半胱氨酸突變體的結(jié)構(gòu)和功能之間是否存在某些必然的聯(lián)系。我們希望這些問題的解答能夠?qū)ξ覀兏钊�、更全面的認(rèn)識高密度脂蛋白抗炎保護(hù)特性的機(jī)制有所幫助。 實(shí)驗(yàn)方法: 利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)對野生型及突變的apoA-I進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá),Ni~(2+)親和柱進(jìn)行目的蛋白純化,獲得多肽鏈C-末端帶有6個組氨酸標(biāo)簽(6×His tag)的高純度蛋白(純度＞90%),再經(jīng)過去內(nèi)毒素處理,最后利用膽酸鹽透析方法做成重組的高密度脂蛋白用于下面的體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)。我們利用尾靜脈注射脂多糖來誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥模型的生成,并以其肛溫升高0.5度作為標(biāo)準(zhǔn),然后再注射重組的高密度脂蛋白。同時為了更加準(zhǔn)確的評估這幾種重組高密度脂蛋白的抗炎性能,我們選擇了兩個時間點(diǎn)加以分析,以注射脂多糖為計時點(diǎn),檢測其注射后3h和24h的重組高密度脂蛋白的治療效果,主要通過ELISA試劑盒檢測血清中的促炎癥因子的水平,并對注射LPS 24h后的小鼠的肺組織做了常規(guī)的病理切片分析。 為了進(jìn)一步探索高密度脂蛋白的抗炎機(jī)制,我們分析了利用野生型aDoA-I及其半胱氨酸突變體結(jié)合脂質(zhì)后形成的重組高密度脂蛋白的成份,即:脂質(zhì)與apoA-I或其半胱氨酸突變體的比率。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 內(nèi)毒素血癥小鼠模型的構(gòu)建: BALB/c小鼠尾靜脈注射LPS后,大約11.5min,即可檢測到其肛溫升高0.5℃,從而可以判定內(nèi)毒素血癥小鼠模型構(gòu)建成功。 血清中炎癥因子的檢測: LPS注射后24h的結(jié)果: LPS注射24h后,經(jīng)ELISA試劑盒檢測,結(jié)果顯示:與野生型A-I構(gòu)建的重組高密度脂蛋白rHDLwt相比,rHDL74和rHDL52更能顯著降低小鼠血清中TNF-α的水平,而且,經(jīng)過rHDL74治療后,其TNF-α的水平已經(jīng)降低到正常水平。與此相反的是,經(jīng)rHDL195及rHDL228處理的小鼠,其TNF-α水平與只注射LPS的對照組相比不但沒有降低,反而升高。另外經(jīng)過rHDLwt處理的小鼠,其TNF-α水平與LPS對照組相比,也明顯的降低。同時,結(jié)果也顯示,rHDLwt及其它半胱氨酸突變體構(gòu)成的重組高密度脂蛋白(rHDL228除外)能顯著降低LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β水平,而且,與rHDLwt相比,rHDL74和rHDL52更能有效的降低IL-1β水平。除此之外,結(jié)果還顯示,rHDL74能顯著降低IL-6的水平,相反,rHDL52及rHDL107卻能導(dǎo)致IL-6水平的升高。 LPS注射3h的結(jié)果: 與LPS注射24h結(jié)果相似,與只注射LPS的對照組相比,rHDL74、rHDL52以及rHDLwt治療后的小鼠有較低的TNF-α水平,但其它重組高密度脂蛋白治療后的小鼠沒有明顯的變化。同時,rHDL74、rHDL52以及rHDL107能降低IL-1β的水平,其它重組高密度脂蛋白對于IL-1β的水平?jīng)]有明顯的影響。另外,沒有任何一種重組高密度脂蛋白能顯著影響IL-6的水平。 肺組織常規(guī)病理切片HE染色分析: 結(jié)果顯示,只注射LPS的對照組,其肺組織有明顯的病理學(xué)變化,包括:1)充血;2)肺間質(zhì)組織增厚;3)白細(xì)胞浸潤,包括單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。而經(jīng)過rHDLwt治療后的小鼠的肺組織切片只顯示了較輕的病理學(xué)變化,比如:較輕的肺間質(zhì)組織增厚等等。經(jīng)rHDL74治療后的肺組織切片強(qiáng)力支持其具有保護(hù)肺組織抵抗LPS誘導(dǎo)的肺損傷,其HE染色結(jié)果非常接近只注射生理鹽水的對照組的染色結(jié)果,基本上沒有明顯的病理學(xué)變化。然而,rHDL228處理過的小鼠的肺組織切片卻顯示出相對于只注射LPS的對照組更嚴(yán)重的病理學(xué)變化。經(jīng)其它幾種重組高密度脂蛋白處理后,小鼠肺組織的病理學(xué)變化都明顯比只注射LPS組的小鼠的肺組織要輕一些,顯示除了rHDL228外,其它幾種高密度脂蛋白都能發(fā)揮一定的抗炎作用。 重組高密度脂蛋白成分的分析: rHDL74中的DPPC與apoA-I的質(zhì)量比率要比rHDLwt中的高(1.93±0.06 vs.1.75±0.11),相反rHDL228是幾種重組高密度脂蛋白中比率最低的,與rHDLwt相比,rHDL228:(0.82±0.05 vs.1.75±0.11,P＜0.05);rHDL107(1.49±0.12 vs.1.75±0.11,P＜0.05)and rHDL129(1.47±0.04 vs.1.75±0.11,P＜0.05),這三種高密度脂蛋白中的DPPC與apoA-I的比率與rHDLwt相比都有所降低。其它重組高密度脂蛋白未見明顯的差異。 結(jié)論: 1.rHDL74及rHDL52比rHDLwt更能有效的降低炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平。 2.rHDL74比rHDLwt更能有效的降低炎癥因子IL-6的水平。 3.rHDL74及rHDL52能夠比rHDLwt更有效的保護(hù)肺組織抵抗LPS誘導(dǎo)的損傷。 4.rHDL228不但沒有任何抗炎作用,相反它還能加劇炎癥反應(yīng),增加LPS誘導(dǎo)的肺損傷。 5.rHDL74中所含有的DPPC要比rHDLwt高,相反,rHDL228中的DPPC是這幾種重組高密度脂蛋白中最低的。 總之,半胱氨酸突變體不僅對apoA-I的二級結(jié)構(gòu)和體外功能造成了一定的改變,而且還對其體內(nèi)中和LPS的抗炎功能產(chǎn)生了巨大的影響,基于rHDL74在本實(shí)驗(yàn)中的保護(hù)作用,它可能會成為臨床上極具潛力的治療內(nèi)毒素引起的敗血癥的基因工程藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2415473