【摘要】： 目的: Alu和L1(long interspersed nuclear element 1,長(zhǎng)散布重復(fù)序列1)兩種重復(fù)序列占人類基因組DNA的27%,研究其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)理對(duì)于認(rèn)識(shí)非編碼序列的生物學(xué)作用,了解人類基因組結(jié)構(gòu)的功能有重要意義。實(shí)驗(yàn)研究和基因組學(xué)分析顯示L1與基因表達(dá)下調(diào)有關(guān);在容易失活的基因、等位排斥基因及其側(cè)翼存在較多的L1序列,比如免疫細(xì)胞的B細(xì)胞受體基因,T細(xì)胞受體基因,細(xì)胞因子中的白介素2基因等。多數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示Alu下調(diào)基因表達(dá),基因組分析和少數(shù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示Alu可以促進(jìn)基因表達(dá),在人類基因組中Alu元件可以散在分布也可以串聯(lián)分布;在基因組中L1重復(fù)序列多數(shù)是不完整的序列,所以有必要研究串聯(lián)Alu和L1片段對(duì)基因表達(dá)的影響。本文中將Alu或/和L1片段插入質(zhì)粒報(bào)告基因下游,觀察插入序列對(duì)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄量及轉(zhuǎn)錄終止的影響,再將SV40PolyA序列插入GFP基因下游,觀察Alu和ORF2作為基因側(cè)翼序列對(duì)基因表達(dá)的影響,并對(duì)Alu序列是否影響染色質(zhì)構(gòu)象進(jìn)行研究。 方法:1表達(dá)載體構(gòu)建合成帶適當(dāng)酶切位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增pORF2質(zhì)粒上的ORF2片段(L1第2讀碼框的1006bp-1285bp,稱為280-4),酶切后插入pEGFP-C1質(zhì)粒,獲得pEGFP-280-4*1(p280-4*1),重復(fù)插入280-4構(gòu)建出p280-4*2,p280-4*4,p280-4*8,p280-4*14串聯(lián)表達(dá)載體。 將酶切回收的280-4*1,280-4*2和280-4*4按正、反方向插入pAlu14的Alu14上游,獲得六種質(zhì)粒。 pORF2(L1-ORF2插入pEGFP-C1質(zhì)粒),pAlu1, pAlu2,pAlu4,pAlu8,pAlu14(pEGFP-C1質(zhì)粒GFP基因下游插入1,2,4,8或14個(gè)Alu),pA-Alu14(pAlu14的Alu14上游插入PolyA正序),pAas-Alu14(pAlu14的Alu14上游插入PolyA反序),pΔA-Alu14(pAlu14的Alu14上游插入去除AATAAA的PolyA正序),pΔAas-Alu14,pA-ORF2和pAas-ORF2為本研究室前期工作制備,本研究所用表達(dá)載體見表達(dá)載體一覽表(Table 1)。 2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光觀察將表達(dá)載體用LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察GFP熒光陽性細(xì)胞數(shù)。 3 Northern雜交用PCR法制備32P標(biāo)記的GFP探針。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA,甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。32P標(biāo)記的GFP探針雜交、沖洗后放射自顯影。然后尼龍膜用剝離液處理,用檢測(cè)neo RNA的探針再次雜交,放射自顯影作為對(duì)照。 4 DNaseⅠ消化敏感性PCR擴(kuò)增需要完整的模板,經(jīng)DNaseⅠ切斷的模板不再能被PCR擴(kuò)增,開放的染色質(zhì)對(duì)DNaseⅠ消化敏感,而纏繞的染色質(zhì)對(duì)DNaseⅠ相對(duì)抵抗,所以DNaseⅠ消化后,用PCR擴(kuò)增染色質(zhì)的一定區(qū)段可以約略估計(jì)該區(qū)域的染色質(zhì)包裝狀態(tài)。pAlu1和pAlu14轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取細(xì)胞核,用DNaseⅠ消化1分鐘或3分鐘時(shí)間,終止反應(yīng)后作為PCR模板,使用四對(duì)引物分別擴(kuò)增GFP基因和融合基因。 結(jié)果:1重組質(zhì)粒鑒定構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶酶切分析,PCR分析和測(cè)序后可知,重組質(zhì)粒中所插入的片段與預(yù)期長(zhǎng)度一致,核苷酸序列正確無誤。Fig.2為280-4串聯(lián)表達(dá)載體酶切電泳圖;Fig.3為p280-4*2測(cè)序圖及序列。Fig.4為280-4*1,*2,*4正、反方向插入pAlu14表達(dá)載體的酶切電泳圖和PCR電泳圖。酶切,PCR和測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)要求和參照序列一致。 2 Alu和280-4串聯(lián)序列對(duì)GFP基因表達(dá)的影響質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,p280-4*1,p280-4*2,p280-4*4,p280-4*8,p280-4*14和pEGFP-C1熒光細(xì)胞陽性率值分別為:(4.7±1.30)%,(2.5±0.30)%,(1.8±0.30)%,(0.5±0.30)%,(0.1±0.30)%和(35.3±2.66)%。隨著280-4片段插入數(shù)目增加熒光陽性細(xì)胞逐漸減少,p280-4*1熒光陽性細(xì)胞率是p280-4*14的47倍(Fig.5)。pAlu1, pAlu2, pAlu4, pAlu8和pAlu14轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的熒光陽性率已另文報(bào)道。 Alu和280-4不同插入個(gè)數(shù)的串聯(lián)序列質(zhì)粒和pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,提取RNA,Northern雜交檢測(cè)顯示,隨Alu插入片段增加,轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度增加,轉(zhuǎn)錄量減少。計(jì)算pEGFP-C1/pAlu1,pAlu1/pAlu2,pAlu2/pAlu4,pAlu4/pAlu8和pAlu8/pAlu14轉(zhuǎn)錄相對(duì)量的比值分別是:1.18,1.14,1.39,1.58和55.5,可見從pAlu8到pAlu14發(fā)生了更加明顯的抑制作用。p280-4*1,p280-4*2,p280-4*4,p280-4*8和p280-4*14質(zhì)粒Northern檢測(cè)結(jié)果為:隨插入片段增加,轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度增加,轉(zhuǎn)錄量減少,抑制程度超過Alu插入(Fig.6)。 3 SV40Poly解除抑制將PolyA及去除AATAAA核心序列的PolyA按正、反方向插入pAlu14質(zhì)粒的Alu14上游,使Alu14成為基因側(cè)翼,均可以部分解除Alu14對(duì)GFP基因表達(dá)的抑制作用,PolyA反序解除抑制的能力高于其正序,去除AATAAA核心序列的PolyA解除抑制作用基本不變,而且仍然發(fā)生轉(zhuǎn)錄終止;PolyA正、反序列同樣解除ORF2對(duì)GFP基因的抑制作用(Fig.7)。 4 280-4與Alu混合排列對(duì)GFP基因表達(dá)的作用pAlu14質(zhì)粒Alu14前按正、反方向插入1,2,4個(gè)280-4,隨著插入片段的增大,轉(zhuǎn)錄減少,插入反序280-4轉(zhuǎn)錄多于正序。280-4串聯(lián)序列反方向插入pEGFP-C1質(zhì)粒,GFP基因轉(zhuǎn)錄多于正序插入,在pAlu14的Alu14的上游插入280-4觀察到類似的現(xiàn)象(Fig.8)。 5 DNaseⅠ消化敏感性pAlu1和pAlu14轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,提取細(xì)胞核,DNaseⅠ消化,分別用四對(duì)引物擴(kuò)增,擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為:GFP5F/GFP4R(215bp),GFP2/GFP3(311bp),1GFP1F/Alu2(460bp)和ECor-xba/Alu2(340bp)。pAlu14消化1分鐘可擴(kuò)增出特異條帶,消化3分鐘無擴(kuò)增條帶,而pAlu1轉(zhuǎn)染細(xì)胞核,兩個(gè)消化時(shí)間均無擴(kuò)增條帶,顯示pAlu14的GFP基因和融合基因?qū)NaseⅠ消化的抵抗性高于pAlu1(Fig.9)。 結(jié)論:1 Alu越長(zhǎng)抑制上游GFP基因的能力越強(qiáng)。 2 Alu屬于轉(zhuǎn)錄延伸序列,不發(fā)生提前終止。 3 L1-ORF2-280-4也屬于轉(zhuǎn)錄延伸序列,但是轉(zhuǎn)錄作用比Alu弱,不發(fā)生提前終止。 4 Alu14和ORF2上游插入PolyA正、反和去除AATAAA的PolyA正、反,使Alu14和ORF2作為基因側(cè)翼序列,對(duì)GFP基因的抑制作用明顯減弱,且不受PolyA正、反序列和去除AATAAA信號(hào)的影響。 5 Alu和280-4串聯(lián)顯示,280-4越長(zhǎng),抑制作用越強(qiáng)。 6 Alu14抑制上游GFP基因表達(dá)與染色質(zhì)包裝有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R394

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2414655