【摘要】： 目的:了解TGF-β家族成員BMP-2/BMP-4是否能夠替代TGF-β,或者促進(jìn)TGF-β體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的能力,及其可能的機(jī)制。 方法:利用免疫磁珠分選出不同基因型小鼠脾臟的Na?ve CD4+細(xì)胞,經(jīng)過TCR刺激,加入IL-2 (20 U/ml),按照不同的培養(yǎng)要求加TGF-β(2 ng/ml), BMP-2 (10 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml)。在體外誘導(dǎo)3天后收集細(xì)胞,用細(xì)胞內(nèi)染色檢測Foxp3的變化。部分培養(yǎng)條件中加入Noggin,JNK和ERK的阻斷劑。Western Blot檢測BMP對Smad1磷酸化的影響。另外,將BMP體內(nèi)注射,觀察外周血,淋巴和脾臟內(nèi)CD4~+CD25~+Foxp3~+T細(xì)胞占CD4~+T細(xì)胞的比例。分離出脾臟的CD4~+CD25~+T細(xì)胞通過混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)分析其抑制功能。 結(jié)果:體外TCR刺激的情況下,BMP-2,BMP-4本身并不能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Foxp3~+T細(xì)胞。Noggin阻斷BMP受體,但并不影響TGF-β體外誘導(dǎo)Treg的能力。BMP-4能夠增加TGF-β體外誘導(dǎo)Treg的能力。體內(nèi)注射BMP不能增加Foxp3~+細(xì)胞的比例,但能夠促進(jìn)TsA增加Foxp3的能力。BMP本身不能夠擴(kuò)增自然Treg,另外BMP聯(lián)合TGF-β誘導(dǎo)后的T細(xì)胞更能抵抗凋亡。BMP-2,BMP-4除了增加Smad1的磷酸化,主要能夠增加ERK,JNK磷酸化來促進(jìn)Foxp3~+ T細(xì)胞的誘導(dǎo)。 結(jié)論:BMP-2,BMP-4單獨并不能夠誘導(dǎo)Treg;無論在體內(nèi)還是體外,BMP都能促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)Treg的能力;BMP這種能力主要依賴于MAKP的ERK和JN K信號。 目的:探討TGF-β誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17生成中TGF-β下游信號機(jī)制,了解這兩群細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化中TGF-β作用的不同信號機(jī)制。 方法:利用Auto MACS來分選出不同基因型小鼠脾臟內(nèi)的Na?ve CD4~+T細(xì)胞。按照調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞不同的誘導(dǎo)條件進(jìn)行體外誘導(dǎo)。根據(jù)實驗要求分別加入MAKP, P38,JNK或ERK阻斷劑。體內(nèi)實驗通過向小鼠腹腔注射TsA,由FACS分析不同基因型小鼠體內(nèi)Foxp3~+T細(xì)胞的變化。利用不同基因型小鼠來免疫誘導(dǎo)EAE小鼠模型,分離出脾臟淋巴細(xì)胞分析Th17含量的變化,一組EAE模型在免疫誘導(dǎo)后注射P38阻斷劑,在相同時間點來分析Th17的含量的變化。 結(jié)果:在體外實驗中,敲除Smad2/Smad3基因后,TGF-β仍然能夠誘導(dǎo)出Treg,但是能力稍弱。當(dāng)加入MAKP,JNK或ERK阻斷劑后能夠明顯削弱TGF-β體外誘導(dǎo)Treg的能力。體內(nèi)實驗中,缺乏Smad3信號時atRA仍然能夠促進(jìn)iTreg的生成和抑制Th17的生成。在EAE模型中,P38抑制劑能明顯降低EAE的發(fā)病程度。 結(jié)論: TGF-β信號是體外TGF-β誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞生成所必須的信號通路;Smad信號在TGF-β誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中只有部分作用;TGF-β的MAKP信號通路在TGF-β誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞生成中也起著關(guān)鍵性的作用。TGF-β下游的MAKP中,ERK和JNK信號通路參與了Treg的分化,而JNK和P38參與了Th17的分化。 方法:體外分離出人外周血PBMC中的Naive CD4~+ T細(xì)胞,在體外經(jīng)過anti-CD3CD28-beads的TCR刺激后,伴有IL-2,和/或TGF-β,和/或Rapamycin(RAPA)誘導(dǎo)7天后,檢測細(xì)胞表面CTLA-4和細(xì)胞內(nèi)FOXP3等的表達(dá)。通過混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)分析誘導(dǎo)后細(xì)胞體外抑制活性。將體外誘導(dǎo)的細(xì)胞和PBMC同時注射到免疫缺陷鼠體內(nèi)觀察其對異種移植物抗宿主反應(yīng)的抑制情況。同時分析人細(xì)胞在小鼠組織內(nèi)的浸潤情況。 結(jié)果:RAPA能夠誘導(dǎo)TCR刺激后的Na?ve CD4~+細(xì)胞成為FOXP3~+T細(xì)胞,該功能在加入ALK5阻斷劑后消失。RAPA聯(lián)合TGF-β能夠誘導(dǎo)出具有免疫抑制功能的CD4RAPA,該細(xì)胞表達(dá)膜表面TGF-β,其體外抑制功能在加入ALK5阻斷劑后喪失。將PBMC(20×10~6)注射給RAG2~(-/-)γc~(-/-)小鼠會誘發(fā)急性異種移植物抗宿主病,同時給予CD4_(RAPA)則能夠明顯延長小鼠的存活時間,減少人細(xì)胞的組織浸潤。 結(jié)論:RAPA能夠增加CD4~+ T細(xì)胞FOXP3的表達(dá),依賴于TGF-β信號;RAPA能夠聯(lián)合TGF-β在體外誘導(dǎo)出類似于nTreg表型的FOXP3~+ T細(xì)胞。這群細(xì)胞高表達(dá)趨化因子的受體,該細(xì)胞本身在TCR刺激時并不在增殖。RAPA聯(lián)合TGF-β誘導(dǎo)的Treg表達(dá)膜表面的TGF-β,其抑制活性依賴于mTGF-β。將RAPA聯(lián)合TGF-β誘導(dǎo)的Treg輸注給RAG2~(-/-)γc~(-/-)小鼠,能夠明顯減輕異種移植物抗宿主反應(yīng),延長小鼠的存活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：2413296