發(fā)布時(shí)間：2019-01-18 09:19

【摘要】： 為了彌補(bǔ)當(dāng)前市場(chǎng)上鹽酸克倫特羅(CLB)快檢方法所存在的缺陷,尤其是以單克隆抗體為基礎(chǔ)操作周期長(zhǎng)、專(zhuān)業(yè)技術(shù)要求高等不足之處,本實(shí)驗(yàn)利用人工合成抗原BSA-CLB免疫日本大耳白家兔獲得了含鹽酸克倫特羅抗體的抗血清,并對(duì)其進(jìn)行效價(jià)鑒定,在此基礎(chǔ)上初步建立了鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法,從而為進(jìn)一步應(yīng)用于市場(chǎng)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。 首先,本研究采用正交試驗(yàn)方法,利用重氮化反應(yīng)原理將CLB和卵清白蛋白OVA、牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)工藝進(jìn)行優(yōu)化,分析了各因素對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響機(jī)理,并在得出的最佳條件下合成了高偶聯(lián)率的免疫抗原BSA-CLB和包被抗原OVA-CLB,通過(guò)紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描分析顯示偶聯(lián)前后載體蛋白的吸收峰發(fā)生了很大改變。以經(jīng)過(guò)改進(jìn)的偶聯(lián)率計(jì)算方法計(jì)算得出OVA-CLB和BSA-CLB的偶聯(lián)率分別為29:1和52.3:1。 以免疫抗原BSA-CLB免疫日本大耳白家兔。免疫期間,以O(shè)VA-CLB包被酶標(biāo)板,采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià),并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果決定放血時(shí)間。免疫四個(gè)月后,獲得的血清效價(jià)最高達(dá)到1:640000。 最后,本實(shí)驗(yàn)利用免疫所得的抗血清,采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法比較不同OVA-CLB包被量、不同抗血清及二抗稀釋度等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,確立了最佳檢測(cè)條件。并在此條件下根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度情況對(duì)檢測(cè)體系的pH值、離子強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化,最終初步建立了以包被OVA-CLB為基礎(chǔ)的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)CLB的方法,檢測(cè)靈敏度高達(dá)0.013μg/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合度高,而且該方法的包被酶標(biāo)板穩(wěn)定性、重復(fù)性較市售酶標(biāo)板好,顯示出很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
[Abstract]:In order to make up for the defects of clenbuterol hydrochloride (CLB) fast detection method in the current market, especially the shortcomings such as long operation cycle based on monoclonal antibody, high technical requirements, etc. The antiserum containing clenbuterol hydrochloride antibody was obtained by immunizing Japanese white rabbits with synthetic antigen BSA-CLB and its titer was identified. An enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) for clenbuterol hydrochloride was established, which laid a foundation for further application in market detection. Firstly, the coupling process of CLB and ovalbumin OVA, bovine serum albumin (BSA) BSA was optimized by using the principle of diazotization, and the influence mechanism of various factors on the coupling reaction was analyzed. The high coupling rate of immune antigen BSA-CLB and coated antigen OVA-CLB, were synthesized under the optimum conditions. UV-Vis full-wavelength scanning analysis showed that the absorption peak of carrier protein changed greatly before and after coupling. The coupling rates of OVA-CLB and BSA-CLB are calculated at 29:1 and 52.3: 1, respectively. Japanese large ear white rabbits were immunized with immune antigen BSA-CLB. During immunization, the serum titers were detected by indirect non-competitive enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) with OVA-CLB coated with enzyme labeled plates, and the bleeding time was determined according to the results. Four months after immunization, the highest titer was 1: 640000. Finally, by using the immunized antiserum, indirect non-competitive ELISA method was used to compare the effects of different OVA-CLB envelopes, different antiserum and second antibody dilution on the detection results, and the optimal detection conditions were established. Under these conditions, the pH value, ionic strength and reaction time of the detection system were optimized according to the detection standard curve and sensitivity. Finally, an indirect competitive ELISA detection method based on coated OVA-CLB was established. The sensitivity of the method is as high as 0.013 渭 g / mL, and the linear fitting of the standard curve is high. Moreover, this method is more stable and reproducible than that of the marketed enzyme label board, which shows a good prospect of market application.
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

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本文編號(hào)：2410548