【摘要】： 實(shí)驗(yàn)背景 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stem Cells, BMSCs)作為目前較理想的組織工程瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的種子細(xì)胞,相對(duì)于其他來源的種子細(xì)胞具有獲取方便、很強(qiáng)的自我更新、多向分化潛能,以及獨(dú)特的免疫特性等優(yōu)點(diǎn)。正常心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞對(duì)于維持正常心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)和功能具有更重要的意義。目前應(yīng)用hBMSCs構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜多需移植入動(dòng)物體內(nèi)后一段時(shí)間才能完成組織工程瓣膜的成纖維細(xì)胞表型和基質(zhì)的最后重塑,尚不清楚hBMSCs向成纖維細(xì)胞進(jìn)行分化的具體機(jī)制以及其功能特點(diǎn)。 BMSCs和成纖維細(xì)胞具有非常相似細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型特點(diǎn)及細(xì)胞表面分子。通過基因組學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞中確實(shí)存在一些差異基因。蛋白質(zhì)組,作為細(xì)胞基因組的最后表達(dá),能夠更詳盡、更直接地描述細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。 目的采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法全面比較hBMSCs和成纖維細(xì)胞中蛋白表達(dá)的差異,進(jìn)一步在蛋白水平理解兩種在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能差異。 方法 1.自正常人髂骨抽取骨髓,綜合采用密度梯度離心和貼壁篩選的方法,分離、純化出hBMSCs,在低糖DMEM/F12培養(yǎng)、擴(kuò)增;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原CD29、CD34和CD45,并對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂多向分化誘導(dǎo),進(jìn)行細(xì)胞性質(zhì)鑒定。成纖維細(xì)胞是人成纖維細(xì)胞系細(xì)胞(購(gòu)自Cell Applications公司)。 2.對(duì)兩種細(xì)胞的蛋白樣本進(jìn)行雙向凝膠電泳分離,通過銀染顯色,獲取兩種細(xì)胞的蛋白組學(xué)圖譜,通過比較兩種細(xì)胞的圖譜,挖取差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖分析和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)信息檢索。選取蛋白進(jìn)行Western Blot和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果。 結(jié)果 1.原代細(xì)胞呈貼壁,集落樣生長(zhǎng);細(xì)胞傳代后,呈梭形,少數(shù)細(xì)胞呈多角形,魚群或放射狀排列。hBMSCs的表面抗原CD29陽性而造血干細(xì)胞具有的表面抗原CD34和CD45為陰性;成骨和成脂誘導(dǎo)后,分別行Von kossa染色和油紅-O染色結(jié)果呈陽性。實(shí)驗(yàn)從正反兩方面論證、確認(rèn)了所分離培養(yǎng)的細(xì)胞即為hBMSCs。 2.hBMSCs和成纖維細(xì)胞全蛋白提取后,進(jìn)行雙向凝膠電泳分析,共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)得到銀染結(jié)果,兩種細(xì)胞的電泳圖譜蛋白斑點(diǎn)分布模式具有一定的相似性。3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)ImagingMaster 2D Elite 510軟件分析,發(fā)現(xiàn)hBMSCs可以檢測(cè)到782±65個(gè)點(diǎn),成纖維細(xì)胞可以檢測(cè)到760±57個(gè)點(diǎn),這些蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍較廣,但大多數(shù)集中于pH 4～8,相對(duì)分子質(zhì)量15～100 ku區(qū)域。對(duì)其中穩(wěn)定表達(dá)的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行切割,用胰蛋白酶消化后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析,通過UniProtKB/Swiss-PROT和NCBI nonredundant protein databases蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,成功地鑒定出29種表達(dá)蛋白,其中有17種蛋白在兩種細(xì)胞中有顯著差別地表達(dá),另外12種蛋白在兩種細(xì)胞中有相同豐度地表達(dá)。Western Blot的實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果。 結(jié)論 實(shí)驗(yàn)首次對(duì)hBMSCs和成纖維細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究,成功發(fā)現(xiàn)了兩種細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白,這些蛋白體現(xiàn)了兩種細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的異同性。這對(duì)于研究hBMSCs向成纖維細(xì)胞分化以及應(yīng)用hBMSCs構(gòu)建組織工程瓣膜具有重要意義。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 聞重秋;脂肪源干細(xì)胞移植治療骨質(zhì)疏松及其成骨分化蛋白質(zhì)譜構(gòu)建[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2407741